生物工艺学实验.docx

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生物工艺学实验

生物工艺学实验

实验指导

（适用生物工程专业）

屈慧鸽冯志彬程仕伟编写

鲁东大学生命科学学院

实验一呼吸缺陷型酵母菌株的诱变选育

一、实验目的

1、理解呼吸缺陷性酵母的筛选原理；

2、掌握呼吸缺陷性酵母的筛选步骤。

二、实验原理

部分酵母菌在一定的物理（如紫外线）或化学诱变剂作用下发生基因突变而丧失呼吸能力，呼吸缺陷性酵母菌株即为丧失呼吸能力的突变株，其对非发酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，但CO2放出高于对照株，酒精脱氢酶活力也较对照高出1倍左右，对提高酒精产率有好处。

同时，呼吸缺陷型也是育种工作可利用的一个有效的遗传标记。

三、实验材料

1.菌株：

酒精酵母

2.培养基

CM培养基：

葡萄糖40gMgSO42g

蛋白胨10g琼脂18g

酵母膏5g水1000ml

KH2PO45g

不加琼脂即为液体CM，分装20ml于250ml三角瓶中。

TTC上层培养基

葡萄糖5gTTC（红氮四唑）0.5g

琼脂10g水1000ml

分装，121℃灭菌15min。

TTC下层培养基

葡萄糖10gMgSO47H2O0.4g

蛋白胨2g琼脂18g

酵母膏5g水1000ml

KH2PO41gpH5.5～5.7

MM甘培养基

酵母膏6.7g甘油20ml

水980mlpH5.5

琼脂粉18g

分装，121℃灭菌10min。

3、仪器设备

紫外诱变箱、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱

四、操作步骤

1、培养基配制：

配制实验过程中所需全部培养基并准备诱变及筛选所需的移液管、试管、平板等物品，121℃灭菌20min，其中TTC上层板培养基灭菌后备用，无需倒平板；

2、菌种活化：

取活化后的酵母菌1环，接入到三角瓶中液体CM培养基，200r/min、30℃振荡培养过夜；

3、菌悬液制备：

将培养好的酵母细胞4000r/min离心洗涤3次，调整细胞浓度为106/ml备用，实验过程无菌操作；

4、诱变：

取15-20ml菌悬液于灭菌空白平板内，磁力搅拌器转速为30r/min，调整与紫外灯管距离为20cm，开盖照射45-75s，盖上盖诱变结束；

5、稀释涂布：

将诱变后的菌悬液梯度稀释至10-6，于CM平板涂布，避光培养24-36h，选择菌落个数合适的平板备用；

6、点接：

将CM培养基平板上长出的菌落点种TTC下层平板上，30℃培养24-48h；

7、鉴定：

将TTC上层培养基溶化并冷却（不烫手）后，小心倾入TTC上层培养基上，使其刚好掩埋菌落。

等凝固后，30℃培养2～3h。

此时，平板菌落颜色会区分成红色、粉红色和白色。

呼吸缺陷型突变株为白色菌落。

8、复检：

用无菌牙签将在TTC鉴别培养基上生长的白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上。

注意点种时，先点MM甘培养基，后点种CM培养基，并在平皿上做好标记。

30℃培养24h观察实验结果。

五、实验结果分析

1、描述实验结果计算呼吸缺陷性酵母突变率，并分析实验过程中影响诱变效果的因素；

2、对比并参照其他小组实验结果，评价本小组实验过程中的利害得失

六、数据分析

突变率：

平板计数法

七、思考题

1、分析呼吸缺陷型突变株为白色菌落为白色，其它菌株红色、粉红色的机理。

2、呼吸缺陷性酵母筛选工作有何现实意义？

3、如果白色小菌落分别点种到MM甘培养基和CM培养基上培养后都有生长，讨论有哪些原因？

实验二红曲发酵及红曲色素的提取

一、实验目的

1、了解红曲菌液体菌种的制备方法,为红曲发酵实验准备液体种子。

2、了解固体发酵的工艺过程,在实验室中小规模制备红曲。

3、熟悉从红曲中分离代谢产物的方法，以及掌握红曲色素色价的测定方法。

二、实验原理

红曲霉菌属真菌界（Eumycophyta）、子囊菌门（Ascomycota）、真子囊菌纲（Euascomycetes）、散子囊菌目（Eurotiales）、红曲菌科（Monascaceae）、红曲菌属（Monascus）。

由红曲霉接种于大米发酵得到的红曲是我国古代的一大发明，称为丹曲，至今已有1000多年的历史，很早就应用于食品着色、食品发酵以及中医中药。

红曲霉作为红曲的生产菌,以其可产生大量天然色素而著称。

红曲的应用主要有三方面：

食品色素、药物和发酵食品。

红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的天然色素，是红曲霉的次生代谢产物，具有热稳定性好，蛋白着色力强，色调柔和，可以提高加工制品对光和氧稳定等优点；而且红曲色素无毒性、无致突变作用，安全性很高，因此红曲可提供安全性高的天然色素。

红曲色素分为黄色素、橙色素和紫红色素，其中黄色素包括红曲素（Monascin）和黄红曲素（Ankaflavin），橙色素包括红斑红曲素（Rubropunctatin）和红曲玉红素（Monascorubin），紫红色素包括红斑红曲胺（Rubropunctamine）和红曲玉红胺（Monascoru-bramine）。

凡色素的呈色都与其结构有着密切的关系，结构的形式与变化内在决定着物质的呈色与变色。

大米经红曲菌固体发酵后产生了一系列红曲菌的代谢产物,但这些产物的量非常少,大米仍占固体发酵产物的绝大部分体积,为了降低运输成本,常常要对红曲菌的代谢产物进行提取和浓缩。

红曲的代谢产物中既有水溶性组分,也有脂溶性组分,因此可用80%的丙酮（丙酮:

水=80：

20）抽提。

用HCl或NaOH处理可以将其中的酸溶性组分、碱溶性组分和中性组分分开。

选择溶剂一般要注意以下四点：

①溶剂对所需成分的溶解度要大，对杂质溶解度要小，或反之。

②溶剂不能与天然药物成分产生化学反应，即使反应亦属于可逆性的。

③溶剂要经济易得，并具有一定的安全性。

④沸点宜适中，便于回收反复使用。

红色素能溶于80%的乙醇中,可通过萃取从米粒中提取出来,红曲色素在505nm处有最大的吸收峰,可用分光光度计来测定。

三、实验器材与试剂

1．菌种：

红曲5003

2．培养基

玉米面液体培养基（g/L）：

蛋白胨20；玉米面20；酵母浸粉10；硫酸镁0.5；磷酸氢二钾1；硫酸亚铁0.1；pH6.0。

发酵培养基：

大米培养基

3、仪器与设备

恒温摇床,超净工作台,高压蒸汽灭菌锅、旋转蒸发仪、恒温培养箱等。

四、实验步骤

1、红曲液体种子制备：

配制制玉米面液体培养基。

500mL三角瓶中装玉米面液体培养基150mL,包扎后0.lMPa灭菌20分钟；玉米面液体培养基灭菌冷却后,每瓶中接入1/4支红曲斜面菌苔（注意无菌操作）；接种后置30℃恒温摇床中180rpm摇瓶培养3天。

2、固体培养基制备及接种

1）浸米:

25℃以上浸米5—8h,大米吸收水分约在28%～30%。

2）蒸米:

将浸好的米用清水淋去米浆水,沥干,即可蒸米。

上汽火力要强,待全部圆气以后，蒸煮3～5min,出饭率在135%,饭粒呈玉色,粒粒疏松,不结团块。

蒸米不能熟透。

3）摊凉接种:

将蒸熟的曲料倒在超净工作台上迅速打碎团块,摊平冷却到30～32℃然后,每1kg米接种液体种子20ml,充分翻拌混合均匀,操作要迅速,以减少杂菌污染。

3、红曲固态发酵:

将曲料摊在曲盘内,厚度约3-5cm。

32～33℃保温保湿培养。

每天翻曲一次，观察到曲粒表面略有干皮、少数曲粒略有微红斑点等现象时即可“吃水”,使曲粒吸收一定水分,以利菌丝逐渐向内生长。

吃水方法:

一边拌曲，一边向曲盘中喷洒无菌水,使曲粒表面润湿并微有发胀。

培养3天后米粒逐渐成红色。

观察记录色素产生的过程。

培养5-7天后，固态发酵结束的红曲置于鼓风干燥箱内50~60℃鼓风干燥。

4、成品质量检查

外观检查:

曲粒表层光滑紫红,曲粒中心呈玉色,不得有空心和红心。

曲粒断面菌丝均匀，具有红曲特有的曲香,不得有酸气等不正常气味。

生物与理化项目检查:

水分12%以下,容量（l00mL）44.5～46.5g,淀粉含量59-62%,无细菌和其他霉菌污染。

5、红曲色素提取：

1）取200g固体发酵之红曲,在植物粉碎机中将其粉碎；

2）将红曲粉放于500mL三角瓶中,加入提取液（丙酮:

水=80:

20）300mL；

3）室温下浸提1天,每隔2小时摇动一次,过滤；

4）沉淀用同样提取液洗涤2次,每次100ml,合并滤液；

5）在旋转蒸发仪中减压蒸去丙酮（尚有水分）；

6）用lmol/LHCl调残留液（约l00mL）的pH至3.0,加至分液漏斗中；

7）用150mL醋酸乙酯分次抽提；

8）以同样方法按下图分离碱（溶）性组分、中性组分和酸（溶）性组分,观察各组分的颜色；

9）将各分离到的组分在旋转减压蒸发仪中蒸去溶剂,低温保存。

五实验结果分析

1、根据实验结果绘制红曲色价生成曲线，分析影响红曲色素合成的因素

2、根据红曲色素分离实验结果描述红曲色素组分及特性

六、参数测定

红曲色价测定：

1）称取红曲米样品0.5g,放入带有刻度的lOmL具塞试管中；

2）加入80%的乙醇8mL,摇匀,　60℃水浴保温萃取0.5h；

3）取出冷却,用普通定性滤纸过滤入lOmL量筒中,用80%乙醇洗涤残渣2次,合并滤液,并用80%乙醇定容至10mL；

4）以80%乙醇作对照,在505nm波长下,用lcm比色皿测定样品的吸光度。

5）计算:

红曲色价（以lg样品计）=A505×lO×2

注意：

发酵后期,若红色素产生量多,可稀释后测定。

七、注意事项:

1.无水Na2S04可回收,反复使用,不要扔掉。

2.有机溶剂易燃,注意远离火源,原则上应在通风柜中进行。

八、思考题:

1．比较固态发酵与液体发酵的优缺点，并指出固体发酵的应用范围。

2．萃取后米粒中仍带有红色,是否会对结果产生影响?

附：

红曲代谢产物分离工艺流程图

实验三苏云金芽孢杆菌的培养及粉剂制备

一、实验目的

1、学习苏云金芽孢杆菌的种子制备、发酵生产和产品检测的方法；

2、掌握苏云金芽孢杆菌发酵生产的调控原理。

二、实验原理

苏云金芽孢杆菌是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，是应用最广的一种微生物杀虫剂，它的主要活性成分是一种或数种杀虫晶体蛋白（insecticidalcrystalproteins，ICPs），又称δ-内毒素，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫，以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物都有特异性的毒杀活性，而对非目标生物安全因此，Bt杀虫剂具有专一、高效和对人畜安全等优点目前苏云金杆菌商品制剂已达100多种，是世界上应用最为广泛、用量最大、效果最好的微生物杀虫剂，因而倍受人们关注。

杀虫伴孢晶体蛋白本身无毒，在酸性条件下会变性失去作用，对于人和哺乳动物，当它进入机体后，马上在胃酸作用下变性，而在腔肠动物体内，没有酸性环境，不会马上变性，在碱性条件下马上分解，释放毒性蛋白，起到对集体的毒害作用。

利用发酵法可实现苏云金芽孢杆菌的大规模培养，最后加工成含有芽孢、伴孢晶体及其他毒素的粉剂。

三、实验材料

一）设备

发酵罐、摇床、显微镜、干燥箱、高速离心机

二）菌种

苏云金芽孢杆菌

三）培养基（%）

斜面培养基

酵母粉0.5，蛋白胨1，NaCL0.5，pH7.0

种子培养基：

葡萄糖2，酵母浸粉0.5，蛋白胨0.5，K2HPO40.1，MgSO40.05，硫酸铵0.5，pH7.0

发酵培养基:

葡萄糖3，酵母浸粉0.5，玉米浆1，K2HPO40.1，MgSO40.05，硫酸铵1，pH7.0

四、实验步骤

1、斜面菌种制备：

接种针挑取1环原始菌种，于斜面培养基划线，在恒温培养箱30℃培养24h；

2、液体种子培养：

挑取1环培养好的线面菌株，接种到含50ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，在200r/min、30℃条件下培养12h左右，待菌体OD净增达到0.5以上时转入发酵培养基；

3、发酵罐培养：

配置好发酵培养基，进行原位灭菌，待培养基温度冷却至30℃时按10%种量接入培养好的种子液，调节进气和尾气阀门维持罐压在0.5Mpa以内，转速200-700r/min，通气量0.8-6vvm，溶氧在20%以上，温度30℃，pH7.0，过程中流加NaOH或氨水调节pH在7.0，培养至菌体浓度在20亿/ml，90%菌体细胞形成内生芽孢时停止发酵；

4、粉剂制备

取一定体积发酵液于4000r/min离心机离心10min，弃上清取沉淀，于50-60℃干燥箱烘干即为苏云金芽孢杆菌粉剂。

五、实验结果分析

1、采用平板计数法计算发酵液菌体浓度并利用细菌计数器计算芽孢形成率；采用平板计数法计算粉剂中芽孢数量,根据实验结果分析影响菌体生长及芽孢形成的因素

2、根据实验结果绘制时间与还原糖、溶氧、转速、通气量、pH及菌体浓度的过程曲线，并解释曲线变化的原因

六、参数测定方法

1、菌体OD：

发酵液稀释20倍，采用分光光度计于600nm测吸光值

2、还原糖：

斐林试剂法

3、活菌计数：

平板计数法

七、思考题

1、简述苏云金芽孢杆菌的杀虫原理；

2、利用发酵罐培养苏云金芽孢杆菌过程中，溶氧对菌体生长有何影响。

3、为了解发苏云金芽孢杆菌发酵过程中二氧化碳浓度的变化，请设计实验测定尾气中二氧化碳浓度的方法，并说明实验原理。

附录发酵液中还原糖的测定方法

（亚铁氰化钾快速法）

1试剂与溶液

1.1费林氏甲液

称取分析纯硫酸铜（CuSO4·5H2O）15g及四甲基蓝（次甲基蓝）0.05g,用蒸馏水溶解,定容至1000mL。

1.2费林氏乙液

称取分析纯酒石酸钾钠50g，分析纯氢氧化钠54g及分析纯亚铁氰化钾4g，用蒸馏水溶解，定容至1000mL。

1.30.1%葡萄糖标准溶液

精确称取在105℃烘2～3h至恒重的分析纯无水葡萄糖1.000g,放入100mL烧杯中,用蒸馏水溶解,定容至1000mL,为防染菌,可加5mL浓盐酸后再定容。

2测定方法

2.1样品处理及吸取

吸取样品10mL,用蒸馏水稀释定容至100mL,摇匀吸取稀释液1mL进行测定。

稀释度及吸取量根据含糖量可予增减。

2.2空白滴定

精确吸取费林试剂甲、乙液各5mL放入150mL锥形瓶中,加蒸馏水10mL。

再用滴定管加入0.1%葡萄糖标准液9mL。

摇匀，在电炉（或煤气灯）上加热,使其在2min内沸腾,沸腾30s后,匀速滴入0.1%葡萄糖标准液，至蓝色消失即为终点。

记录沸腾前后共耗用葡萄糖液毫升数（A）。

2.3预备滴定

精确吸取费林甲、乙液各5mL,放入150mL锥形瓶中,加蒸馏水10mL,再加1mL10%样品稀释液。

根据样品含糖量的高低（估计数）,可用糖液滴定管先加入一定量的0.1%葡萄糖液（空白滴定耗用葡萄糖液一般在10mL以上）,摇匀加热,沸腾30S后,匀速滴入0.1%葡萄糖液,至蓝色消失即为终点,记下沸腾前后共耗用0.1%葡萄糖标准液毫升数,作正式滴定时参考用。

2.4正式滴定

精确吸取费林试剂甲、乙液各5mL,放入150mL锥形瓶内,加蒸馏水10mL及1mL10%样品稀释液,再用糖液滴定管加入比预备滴定耗用量少0.5mL左右的0.1%葡萄糖标准液,摇匀后加热,使其在1～2min内沸腾,沸腾30S后匀速滴入0.1%葡萄糖标准液，至蓝色消失即为终点,记下沸腾前后共耗用0.1%葡萄糖标准液的毫升数（B）。

做平行测定,两次相差不得超过0.1mL。

3计算

（A-B）×C

还原糖（以葡萄糖计,g/100mL或g）＝─────×100……………

（1）

W

式中：

A——空白滴定耗用0.1%葡萄糖标准液数,mL

B——正式滴定耗用0.1%葡萄糖标准液数,mL

C——1mL0.1%葡萄糖标准液含葡萄量（即0.001g）

W——吸取样液相当样品量,mL或g。

4注意事项

4.1每批试样测试前必须做空白滴定,二次平行测定误差不得超过0.1mL。

4.2空白滴定、预备滴定及正式滴定操作条件应保持一致。

滴定速度应以每秒1～2滴为宜。

热源要稳定,在正式滴定时,待试样沸腾后,标准糖液的滴定量必须控制在0.5～1mL之内,否则要重做。

整个滴定过程必须始终保持沸腾状态。

4.3凡样品含糖量在6%以上时,应适当增加稀释倍数,否则会加大误差。