色谱峰色谱柱与参数.docx

色谱峰色谱柱与参数.docx

《色谱峰色谱柱与参数.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《色谱峰色谱柱与参数.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

色谱峰色谱柱与参数

柱效

N=梆妃瑞旅懺.'WJF逊齒硕磁3主釜期铲峥縞

*=^wst-

柱效常常是指塔扳数「这种表彼方法是、lartin和Syn驴挺宙来的抑他们把披分忻物在两和之间的平衡和分馅理论联亲虚一起审怏田这种方法把色谱柱

分为着羽期稣A.样晶纽分bi卩订如»«#91«定檳義》沁M间进

甸_细叫瓠蹄C13淞的觀良豪曲奏平鹭的枕裁也s

耐觀gw跆1WS1R晦耐

上向列出了计算桂效的处式「他们是从分配理论和随机统计学推倒出来的,对4.6x100mm裝5pm填料的色谱柱典型桂救律5000到毎000培板数之何卜自然/色谱峰的塔板数越髙分敬性越小总

理论塔板数常用于对给定方法的色谱村.确定其柱敛•方法的开发渚要决定当色谱林的林效降低到某一预宦数值乏后就不能再"昇这时就魏垫换新的色谐柱了.

在理恕的情况卜，色谱峰感该足髙斯峥或对称山仁但足由于超柱勢W样品在网定郴上的吸附或色谱柱康不正常.使色谱峰岀现拖疋。

可UM吏用不对称公式计算色锻眸的疥对称度，上面所列公式足在分析中所用公武的一种卩和柱效的公旣一桦渥方法认证人员<以决定当不对称度超过某一数值时这一方法无敢：

一繼当平对称歷览3襲更高时就平适合于积分和定蛍分折。

••••«T<.・.L•.

分离度

总起衣讲.也响邑谱昨之间!

分備度的凶索仃〔介・它们是客吊,打黄口选抒性悝捉潮桂效.N>伯谱邺尖锐。

主粪足尬谱柱爬度r类型“和颗料应大小徨林底_罔障.增加暮lb氐冷是僅酋腳•綸崛|話眸一握麗册區Th左饗是魏刹相刑讎爾hnul副咦・«>是歿愉此靠無

一些还是暄离远程主墓艮健合相*施勒相利温度控制这一因索.

©rfj.J75-*|u□nnJFQQ

却m桃网肌Moto的册和卿积.

wuu…’

缩短柱长但/）同时减小粒度⑴历能:

一保持分离度

-缩短分祈时阖

-减少辨利用呈

注*：

3.5gmM粒度的填料可以便用2urn的沙芯过滤3L这一过滤塞比便用0.5Mmit逮寒的优点是不易被小颗粒杂质堵塞°

色谱柱直径

保留值和卑祁降低誨停B就降低

-cPSpXbmnMf）VM

上面的数期说明从小内径色谱林洗脱出来的色港峰其容积很小F峰扩散也很小®阂此被稀释的稈疫很小"

死时间（deadtime,tO）--不保留组分的保留时间。

即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。

在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

fj

umi

L|

r

ml，

PL

1IUU

死体积（deadvolume，V0）--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占

据的空间。

它包括4部分：

进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被

流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。

其中只有Vm参与

色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。

为防止峰扩展，这3部分体积应

尽量减小。

V0=FXt0（F为流速）

min

E虑瘋建拘EBOniuiE

沽林浦.速的20%•jllLv面

裝填511111

亍十4.6itLEii■餐

装轨5pm塌料的4,6mmi孔色卸

板诞，且有祐同山泾色谱桂宴拗打R片问样乩血述・琳独截面比

鼻郁裁折财为i^Dlll■色谕旌需甕守滴rnL.绻

2-1.huh

F亘F少使用UFffl陳出螫H

FlowRe©；*“

Flow何at亀

ColumnLd・

（5u.m

FlowmUmin

人4-fi.

1-2

3.0

0.4-Q：

8

2J

-0.4

_IQ

二03

屋橄<戸屉直的葆覇找序

%s•,o'1°・%°wt°co-，r»击石q・口

祥减分子的錯构会沟你抛供一个洗脱桃序的贱索「洗腸次序覺分子在水中濬鱗度和奋碳含Sft的控舲几观祭到的控的前样品洗刃亜次序询■盅

••■•«.0“<••O

315）在水申溶郦虞越才、保留俏越大址^1（5）分了中碳数爭保甸值就增加。

217）支昭匕台物的伽:

禅丰俏彳氐于未匸圧构畀构体寸218）军饱刑化舍物保留值幡低*

空丄刃「般的诡1B次J夢戈M

脂肪煤》诱导借粧A承久糾极*斓碱二弱酸“弓虽酸特稱乎型化音物一般以电谱桂死体积状态流岀7

流动相

厦相HPLC所用溶剂］

w^nr:

t5*jja\ru3齐之”尸y—v7xT严*

u

1°

%

反相色谱的流动相常含有水和缓冲溶液和能与水混溶的有机溶祐水或水/缓冲溶液足最弱的流动札在分离屮性化合物时不需要添加缓冲溶液.有机溶剂强度比水大，在流动相中增加有机溶剂的卅将会使样晶史快地洗脱出色谱柱・流动相中增加水的含量会增加样品的保静时间,改变流动相中的有机纽分会改变兀选择性，因而也改变样品的洗脱次序©

选择键合相

jgefiwtt

—V：

'8-*^^**"*1・oITe

■

c-ia,保■性豪・，《|加m«柱的透择

岂胶

亠咔R

«0BMk.4

C-3.C4.M，■定性K一些・促・

°二

□

辄■，用性很强.量1K用的ftftfi*色常填料

相合功■团的好因定弱HI夷子交接刻

■■色H柱

©

AWt^别

■umBW墓苹pHi-u怯效低

在反相色谱柱中键合郴填料有明显的差别虫到冃前为止・最常用的反相色谱員删是十甌基怨曲胶「G1&玄是一种耐用和保留性能强的囲定柿c-8类似于U8只迪保IS值小1豊・偶尔11*现0**1£和的保留談犢育所不同■但并非恵是如此，短链疑G3C-4,不如前者稳定.但是常用于肽和蛋白质的分析$苯基耳MK.和氨基柱^048相比,彼此之间具有不同的选择氐亂基柱对不同极性基团的化合物很有用庁是很耐用的色谱柱晌氨基柱冷够稳定,传

8,

统上宓是分离磺水化合物或“WT的色谱柱强苯皋柱的极性强丁U18或GK・电子云提供了和芳香族化合物作用的条件.

艮聚台端为基的色谕住人们沁窓在宽的施SHAMBi空龙■但是它的柱效不如以硅胶为基的色谱柱。

弱酸的分离

到现在为止讨论集巾在反相HPLU分离中性化合物上「反相HPLC：

也是分离离子型样品极好的方法包在溶液中的弱酸可以中性或禽子形式存在,在离解时成为魏离子「在窩pH弁质中分子星负离子状态’在览状态下分子主要为亲水性"所以分子的保留值很低第对某些分子在此情况下可以说完全没有保留作用尊

•0

"流动相的pH降低到样品的pK时.分f就同时存在中性和离/两种形态「流动相的pH接近于样晶的pK聯佔计色谱峰会变宽而且峰瘫难看©当流动相的pH讯pK低1$到2个单位时，分子星中性.在此情况卞分子的疏水性强「保留值最大一般上弟色谱工作者把流动相的pH调节到使分子星中性，使芽保留值达到晟大而且保留时间的精密疫商,所以色谱工作者把流动相的pH调节到比塢股的pK值低QpH单位,这•技术叫做离子抑制方法©但足「你必须记住对以硅胶为基的键合固定相的安全操作范困足pH2到乩在极端pH条件下色谱柱的使用寿命会受到威胁孕

这、张图说名弱酸或弱碱如何随流动相的pH变化保留值的改变令要注意在pH接近弱殻或弱碱的pK值时变化最厉暮这就是说pH稍有变化，保留值就会仃很大的改变利如果在霜近弱酸或弱碱pK值处保留时间的重复性就不好，峰形也变坏©长而且煤性不妬这是由手和残余硅醉基作用的缘故■但是碱性化合物不能总是在离子抑制条件下进行分离■分析工作者必须提高pH便分子皇中性，但是在高pH下的流动相会损坏硅胶基质的色谱柱，硅胶在pH8议上很容易溶解霉但足有一些硅胶基的色谱柱在此条件下性能比一般莊胶基色谱柱耍稳定「以聚合物为基的色谱柱是另外一种抗高pH介质的同定札便用预柱便流动相使被溶解的程胶得到预饱和”以便减少对色谱柱的损坏.

控制pH的缓冲溶液

为了控制弱酸和弱碱的保用时剧•流动相的pH必须严格控制，必须嗨选择适皱抻删解系并精心地制斟踊祕±wiaHtehplc常用的绥冲洛液,种特殊的缓冲溶液貝在一定的pH范围是稳定的•缓冲溶液耍有足够的浓度，但碎熨过度,一般HPLC的缓冲溶液浓度范用在瓷到100111M.应当使用质量最好的试剂制备缓冲溶液，便用经过校准的pH让滴逞缓冲溶液到指定的pH.戒者使用制备的缓冲溶液撕耍把缓冲溶液进行过滤除去任何颗粒物质直耍把缓冲沸液冷冻保仏或在使用时再制备.園为许多缓冲溶液会促进细佝的生长”

控制pH的缓冲溶液

缓沖務液總OB柱稳定性的影勇

色储柱:

46x150minZorbaxXDB-C8;冲就:

邓AGN嶼肠OQM缓冲液少pH73L0mL/min;TestfiOTbACKM^OOlM碍酸钠缓冲熔J0LpH70315mUimirSTC

上述数据说明缓冲溶液的选择能影响色谱柱填料的与命,虽然柠檬酸盐缓冲溶液廿色耕存命藝好F磷酸汕但是柠檬酸卅对fI器的不锈钢零件有腐蚀作用.

要记住在不用仪器时"定耍把缓冲溶液从色谱柱和仪器中冲洗出去卜斗流动相中含有缓冲溶液时停流是极坏的条件,高温卜使色谱柱和其他仪器部件扯露在流动相和添加剂中峯也会加速它们的损坏严

a•1®«•••a•°3•

含盐缓冲懈液的流动相千万不聲让它在泵系统中蒸发干，这样会损坏比例

N.塞的耐tfh別心的細慨M蝮永久性胸鮭■缓讨静坏

可能再溶解和沉淀尊

弱碱的分离

胺在硅醇基上的第二次保留

0^3临口<£□卩•…论°V°巴忌53u

三乙胺廉嗪。

在固定相表而上的游离硅醇棊造成不希望有的和碱的第二次作用，顶部的色潜图说明弱碱与游离社醇基典型的作用，样品有很强的保留作用，ote好。

如果加入-个比样品更容易和游离硅醇某作用的化合物，就可以消除硅醇以•減的作用,常用的这类改性制是三乙胺（TEALTHA叫漏痣碱械

剂或保护试剂，典型的情况下加入10-30mM的量就可以减轻或消除这种作用乜在上而的例子里八:

第T图的流动相中只简单地含有磷酸钠，第二个图用哌,嗪做封端试剂，但是它的作用不明显，在第三种情况下使用TEMED

!

1!

（NNZN•四甲基乙二胺）做保护试剂，得到好的结果八但是TEA是更常用的这类试剂。

反相色诺分离离子型样品

弱碱的分离

圍IfcgBpHB?

分裔

上而的例子提离流型相的pH到某程M时，礙不再能质子化復减弱了碱和诉禹硅醇展的作用中姿说明的是对多数色谱桂并不推荐这样做#在pH奇到8以上时細解硅胶向损坏硅胶早的色曲，倒|血中如入三乙jh诫懈封蜩色谱柱则是明智之举书

OO•.OO

分离弱酸和弱碱

分A#ft

开給的选择

ftrttt

15M25）xO4Gcm.

wtm

5>£3.5pm

018^C8

OA觀B

議耀冲辭港/ACN

%B

®*

25imM空丽輒pH£3

2fi■甜mMTEA或TEA己幅船輕需贬

1-2mL/nun.

Jfttt

4CFC

#1R

¥SOpL

<25pg

12

上而总箱了分离含有弱酸和弱碱样品的条件「流动相和添加剂不会影响中性

•«®»«s•・=・•、・*••—・«

化合物毋

梯度方法的建立:

1a-1—k

Rs_（）N（）

4a1k

k-（tGF/1.15W）

Rs:

分离度，表示两峰分离程度的物理量。

k：

容量因子，表示某溶质在固定相和流动相中物质的量的比，在等度洗脱中。

一种物质的k值是恒定不变的。

上面两试针对的是梯度洗脱，k表示的平均容量

因子。

a:

分离因子，两个溶质的容量因子的比。

通常k大的作为分子。

表示两物质分离能力的大小。

N:

理论塔板数，表示柱子的分离能力，也就是柱效。

tG:

梯度时间；F：

流速；Vm:

死体积；应紗：

梯度变化范围。

常见问题和维护：

整个液相系统最值得关注的常数：

压力

除体系受到污染之外，几乎所有柱前的问题都能在压力变化上表现出来。

压力来源：

泵上的压力传感器

最常见的问题：

压力小（几乎为零）：

说明没有流动相流过柱子。

可能原因：

柱前漏夜

流速设为0了

流动相干了

吸滤头没有放流动相液面之下

流路中有大段气泡

处理方法：

漏液：

从泵的出口到柱子的前端接口（柱后漏液几乎不会影响压力值）顺次检查’

泵上有自己的漏液传感器。

检测到漏液。

会停止工作并蜂鸣，变红。

同时显示错

误信息：

ERROR:

LEAKDETECTED。

发现漏液点，先停泵，重新接好。

将漏液擦干。

有的漏液不明显，这时压力的也不会太小，检查时要注意，可用手仔细摸各个接

口，感觉是否湿冷。

PURGE

流路中有大段气泡：

通过大流速（如5ml/min）冲洗可以去除泵体内气泡。

也就是常说的按下泵的面板上的purge键即可。

每次PURGE的时间和流速可以在面板上设定。

通常不改。

初始值应该是5ml/min，3min。

但有时候泵体内空气太多，purge都不可以，或者很难抽上流动相，这是可以在purge的同时，用注射器，在泵的废液出口处抽。

直到没有气泡。

关于偶尔出现的气泡，不用太过在意，因为：

1.有脱气机在。

2.在purge时，由于流速太大，难免会出现气泡。

尤其是在purge阀开超过180度，废液出口处出现气泡就跟平常了。

3.只要气泡不在泵腔内堆积，就几乎不会影响到分析结果。

只要出了泵口，在高压下会

被压缩的很小。

不影响流路的延续性。

所以，只要观察压力变化，如果压力没有异常波动，就行。

在泵体内有气泡堆积时，压力波动会变大。

什么样的波动算正常，需要大家注意观察。

根究经验，在以恒定流速，梯度不变时，面板上以MP为单位的显示值应该几乎不变。

频繁出现的气泡会影响到流路的延续性，应该注意。

吸滤头堵，管路脏（通常是水相）有可能带来频繁出现的气泡。

可以先A，B的溶剂瓶调换一下。

PURGE五次。

后换回来，再PURGE两次。

清洗一下管路。

压力过大：

说明流路堵了逐段排查，先从柱（预柱）前接口（因为柱子最易堵）断开，以一定流速走：

压力正常，说明是柱子及其后的某一段堵了（通常是柱子）。

换柱子（或预柱）压力还高：

说明是柱前某段堵了。

这时再将进样器出口（接柱子）的peek管接头拧下：

压力正常：

说明是这段peek管堵了。

换peek管。

压力还高：

说明是进样器之前的部分堵了。

通常是进样器六通阀堵了。

反冲或清洗流通阀。

其它部分依次类推。

压力波动大：

说明流路中的液流不平稳，这时色谱图通常保留时间不稳定，峰型也不好。

得到的线性，重复性也不会好。

可能原因：

泵体内有气泡，泵头单向阀坏。

先确认是哪一台泵有问题。

先走100%A相。

看是否压力还是波动大，还大则说明A泵有问题。

压力正常则说明A泵正常。

再走100%的B相，过程如上。

确认好泵之后，先purge一下，以驱赶气泡。

Purge两次后，还是压力波动大，这有可能单向阀坏了，需要清洗或更换。

Ctc自动进样器的常用维护操作（实验室现场操作）换针：

调针位：

调针位：

设定洗针体积：

一些小概念：

PEEK：

聚醚醚酮

色谱管道，外径多为1/16inch，1inch=2.54cm，1/16in=2.54cm，内径大小以颜色标准，红色（我们用的）最小，为0.13mm（应该是国际统一标准）

PEEK接头手紧即可不锈钢接头要用工具紧接头分一体的和分为主体和压紧环两部分的。

后者在拧紧的过程中，不易带动管道扭曲变形。

不锈钢的压紧环是一次性的

单位换算：

1MPa=10bar=7500.6torr=14.5psiPsi：

poundpersquareinch（psi）

Torr:

托里彻利，标准大气压的1/760。

也就是mmHg（毫米汞柱）其它问题：

残留大:

可能由于流通阀堵塞，

很可能是洗针过程有问题，注意观洗针时有没有抽上液体，多气泡。

出现过由于转子磨损，洗针液不能顺畅流出进样口洗或更换转子也可能进样过程有问题，注意观察进样针活塞是否推到底。

造成压力大，进样针没法推到底。

重现性不好:

内标波动大，可能喷雾针脏了，使得喷雾不均匀。

可能是液相方法没有开发好。

峰型差，峰太宽都有可能造成面积不重复（不会差别太大）。

注意观察重现性不好的那几针，是否峰型比较特殊，保留时间也有较大变化，如果是，很有可能是由于pump里进了气泡，造成流速不稳，这点可以从压力变化得到确认，但是好像没法记录压力曲线。

质谱检测器的色谱图：

chromatogram，强度和时间的图。

等同于紫外检测的色谱图。

质谱检测器的光谱图：

spectrum，某一时间点（段时间内平均）的强度相对质荷比的图

下图上半为一色谱图，下半部为图是灰色方块（2.5min左右）内，平均强度相对质

荷比的光谱图。

类似于紫外中的全波长图。

:

壯輩tT^!

m£i帀砂上邸1嶂arlewnA-^tMi曲］

W=1.70Wi/2

W1/2=0.7则W=0.7*1.70=1.19

差不多刚好实现单位质荷比的分离线性范围：

信号强度与样品浓度的关系可用如下关系式表示：

R=ARCX。

R为信号强度大小，

AR为响应因子。

C为样品浓度，X为指数。

X=1,表示在线性范围之内，考虑到实验误差等因素。

一般只要X在0.98-1.92之间，就认为还在线性范围之内。

线性范围是一个浓度范围，下限比较难测。

通常就以最小检测量或最小检测浓度作为线性范围的下限。

檢测限叫人样&试松

检测器的线性范围