色谱峰色谱柱与参数.docx

1、色谱峰色谱柱与参数柱效N =梆妃瑞旅懺 . WJF逊齒硕磁 3主釜 期 铲峥縞*=wst-柱效常常是指塔扳数这种表彼方法是、lartin和Syn驴挺宙来的抑他们把 披分忻物在两和之间的平衡和分馅理论联亲虚一起审怏田这种方法把色谱柱分为着羽期稣A.样晶纽分 bi卩订 如#91定檳義沁M 间进甸_细叫瓠 蹄C13淞的觀良豪曲奏平鹭的枕裁也 s耐 觀 gw跆1WS1R晦耐上向列出了计算桂效的处式他们是从分配理论和随机统计学推倒出来的, 对4.6 x 100 mm裝5 pm填料的色谱柱典型桂救律5000到毎000培板数之 何卜自然/色谱峰的塔板数越髙分敬性越小总理论塔板数常用于对给定方法的色谱村.确定

2、其柱敛方法的开发渚要决定当 色谱林的林效降低到某一预宦数值乏后就不能再昇 这时就魏垫换新的色谐 柱了.在理恕的情况卜，色谱峰感该足髙斯峥或对称山仁 但足由于超柱勢W 样品 在网定郴上的吸附或色谱柱康不正常.使色谱峰岀现拖疋。可UM吏用不对称 公式计算色锻眸的疥对称度，上面所列公式足在分析中所用公武的一种卩 和 柱效的 公旣一桦渥 方法认证人 员 以决定当 不对称度超过 某一数值时这一方 法无敢：一繼当平对称歷览3襲更高时就平适合于积分和定蛍分折。 T 伯谱邺尖锐。主粪足尬谱柱爬度r类型“和颗料应大小 徨林底_罔障.增加暮lb氐冷 是僅酋腳綸崛|話眸一握麗册區Th 左饗是 魏刹相刑讎爾hnul副

3、咦是歿 愉此靠無一些还是暄离远 程主墓艮健合相*施勒相利温度控制这一因索. rfj. J 75 - * | u n n J FQQ却m桃网肌 Moto的 册和卿积.wu u 缩短柱长但/)同时减小粒度历能: 一保持分离度-缩短分祈时阖-减少辨利用呈注*： 3.5 gm M粒度的填料可以便用2 urn的沙芯过滤3L这一过滤塞比便用0.5 Mm it逮寒的优点是不易被小颗粒杂质堵塞色谱柱直径保留值和卑祁降低誨停B就降低-cPSpXb mnMf) VM上面的数期说明从小 内径色谱林洗脱出来的色港峰其容积很小F峰扩散也很 小阂此被稀释的稈疫很小死时间（dead time , tO）-不保留组分的保留时

4、间。即流动相（溶剂）通过色 谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。fjumiL|rml，PL1IUU死体积（dead volume，V0）-由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm ）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有 Vm参与色谱平衡过程， 其它3部分只起峰扩展作用。 为防止峰扩展， 这3部分体积应尽量减小。V0 = F X t0 （F为流速）minE虑瘋建拘EBOniui E沽林浦.速的20% jllLv 面裝填5 11111亍十 4.6 itLEii 餐装轨5 pm塌料的4,

5、6 mm i孔色卸板诞，且有祐同山泾色谱桂宴拗打R片问样乩血述琳独截面比鼻郁裁折财为iDlll 色谕旌需甕守滴rnL .绻2 -1. huhF 亘F少使用UFffl陳出螫HFlow Re；* “Flow 何at亀Column Ld(5u.m Particles)Flow mUmin人 4-fi.1 -23.00.4 - Q：82J- 0.4_ IQ二 03 屋橄戸屉直的葆覇找序% s , o1 % wt co -，r 击石 q 口祥减分子的錯构会沟你抛供一个洗脱桃序的贱索洗腸次序覺分子在水中 濬 鱗度和奋碳含Sft的控舲几 观祭到的控的前样品洗刃亜次序询盅 .0“ O315）在水申溶郦虞越才、

6、保留俏越大址 1（5）分了中碳数爭保甸值就增加。217）支昭匕台物的伽:禅丰俏彳氐于未匸圧构畀构体寸 218）军饱刑化舍物保留值幡低*空丄刃般的诡1B次J夢戈M脂肪煤诱导借粧 A承久糾极*斓碱二弱酸“弓虽酸特 稱乎型化音物一般以电谱桂死体积状态流岀7流动相厦相HPLC所用溶剂w nr : t5 * jj a ru3 齐 之”尸 yv 7 xT 严 *u1%反相色谱的流动相常含有水和缓冲溶液和能与水混溶的有机溶祐水或水/ 缓冲溶液足最弱的流动札 在分离屮性化合物时不需要添加缓冲溶液.有机 溶剂强度比水大，在流动相中增加有机溶剂的卅将会使样晶史快地洗脱出色 谱柱流动相中增加水的含量会增加样品的保静

7、时间,改变流动相中的有机 纽分会改变兀选择性，因而也改变样品的洗脱次序选择键合相jgefiwttV： 8 - *1 o IT ec-ia,保性豪，|加m 柱的透择岂胶亠咔R0BMk . 4C-3. C4.M，定性K一些促 二辄，用性很强.量1K用的ftftfi*色常填料相合功团的好因定弱HI夷子交接刻 色H柱AWt 别umBW墓苹pHi-u 怯效低在反相色谱柱中键合郴填料有明显的差别虫到冃前为止最常用的反相色谱 員删是十甌基怨曲胶G1&玄是一种耐用和保留性能强的囲定柿 c -8类似于U8只迪保IS值小1豊偶尔11 *现0*1和的保留談犢育所 不同但并非恵是如此，短链疑G3 C-4,不如前者稳定

8、.但是常用于肽 和蛋白质的分析$ 苯基耳MK.和氨基柱048相比,彼此之间具有不同的选择氐 亂基柱 对不同极性基团的化合物很有用庁是很耐用的色谱柱晌氨基柱冷够稳定,传8,统上宓是分离磺水化合物或“WT的色谱柱强苯皋柱的极性强丁 U18或G K电子云提供了和芳香族化合物作用的条件.艮聚台端为基的色谕住人们沁窓在宽的施SHAMBi空龙但是它的 柱效不如以硅胶为基的色谱柱。弱酸的分离到现在为止讨论集巾在反相HPLU分离中性化合物上反相HPLC：也是分 离离子型样品极好的方法包 在溶液中的弱酸可以中性或禽子形式存在,在离解时成为魏离子在窩pH 弁质中分子星负离子状态在览状态下分子主要为亲水性所以分子的

9、保留 值很低第对某些分子在此情况下可以说完全没有保留作用尊0流动相的pH降低到样品的pK时.分f就同时存在中性和离/两种形 态流动相的pH接近于样晶的pK聯 佔计色谱峰会变宽而且峰瘫难看 当流动相的pH讯pK低1$到2个单位时，分子星中性.在此情况卞分子 的疏水性强保留值最大 一般上弟色谱工作者把流动相的pH调节到使分子星中性，使芽保留值达到 晟大而且保留时间的精密疫商,所以色谱工作者把流动相的pH调节到比塢 股的pK值低QpH单位,这技术叫做离子抑制方法 但足你必须记住对以硅胶为基的键合固定相的安全操作范困足pH 2到 乩在极端pH条件下色谱柱的使用寿命会受到威胁孕这、张图说名弱酸或弱碱如何

10、随流动相的pH变化保留值的改变令要注意在 pH接近弱殻或弱碱的pK值时变化最厉暮 这就是说pH稍有变化，保留值 就会仃很大的改变利如果在霜近弱酸或弱碱pK值处保留时间的重复性就不 好，峰形也变坏 长而且煤性不妬这是由手和残余硅醉基作用的缘故但是碱性化合物不能 总是在离子抑制条件下进行分离分析工作者必须提高pH便分子皇中性， 但是在高pH下的流动相会损坏硅胶基质的色谱柱，硅胶在pH 8议上很容 易溶解霉但足有一些硅胶基的色谱柱在此条件下性能比一般莊胶基色谱柱耍 稳定以聚合物为基的色谱柱是另外一种抗高pH介质的同定札 便用预柱 便流动相使被溶解的程胶得到预饱和”以便减少对色谱柱的损坏.控制pH的缓

11、冲溶液为了控制弱酸和弱碱的保用时剧流动相的pH必须严格控制，必须嗨选择 适皱抻删解系并精心地制斟踊祕 wiaHte hplc常用的绥 冲洛液, 种特殊的缓冲溶液貝在一定的pH范围是稳定的 缓冲溶液耍有足够的浓度，但碎熨过度,一般HPLC的缓冲溶液浓度范用 在瓷到100111M.应当使用质量最好的试剂制备缓冲溶液，便用经过校准 的pH让滴逞缓冲溶液到指定的pH.戒者使用制备的缓冲溶液撕耍把缓冲 溶液进行过滤除去任何颗粒物质直耍把缓冲沸液冷冻保仏 或在使用时再制 备.園为许多缓冲溶液会促进细佝的生长”控制pH的缓冲溶液缓沖務液總OB柱稳定性的影勇色储柱:4 6 x 150 min Zorbax X

12、DB-C8;冲就:邓AGN嶼肠OQ M缓冲液少 pH 73L0 mL/min; TestfiOTb ACKMOOl M 碍酸钠缓冲熔 J0L pH 70315 mUimirST C上述数据说明缓冲溶液的选择能影响色谱柱填料的与命,虽然柠檬酸盐缓冲 溶液廿色耕 存命藝好F磷酸汕 但是柠檬酸卅对f I器的不锈钢零件有腐蚀 作用.要记住在不用仪器时定耍把缓冲溶液从色谱柱和仪器中冲洗出去卜斗流动 相中含有缓冲溶液时停流是极坏的条件,高温卜使色谱柱和其他仪器部件扯 露在流动相和添加剂中峯也会加速它们的损坏严a 1 a 3 含盐缓冲懈液的流动相千万不聲让它在泵系统中蒸发干，这样会损坏比例N.塞的耐tfh

13、別心的細慨M蝮永久性胸鮭缓讨静坏可能再溶解和沉淀尊弱碱的分离胺在硅醇基上的第二次保留03 临 口 3.5 pm018 C8O A觀B議耀冲辭港/ACN%B*kS-2D)25 imM空丽輒pH 32fi 甜m M TEA或TEA己幅船 輕需贬1 - 2 mL/nun.Jfttt4CFC#1R SOpL25pg12上而总箱了分离含有弱酸和弱碱样品的条件流动相和添加剂不会影响中性 s = 、 * 化合物毋梯度方法的建立:1 a - 1 kRs _ ( ) N ()4 a 1 kk - (tG F / 1.15W)Rs:分离度，表示两峰分离程度的物理量。k：容量因子，表示某溶质在固定相和流动相中物质的

14、量的比，在等度洗脱中。一种物质的k值是恒定不变的。上面两试针对的是梯度洗脱， k表示的平均容量因子。a:分离因子，两个溶质的容量因子的比。通常 k大的作为分子。表示两物质分离 能力的大小。N :理论塔板数，表示柱子的分离能力，也就是柱效。t G :梯度时间；F：流速；V m :死体积；应紗：梯度变化范围。常见问题和维护：整个液相系统最值得关注的常数：压力除体系受到污染之外，几乎所有柱前的问题都能在压力变化上表现出来。 压力来源：泵上的压力传感器最常见的问题：压力小(几乎为零)：说明没有流动相流过柱子。 可能原因：柱前漏夜流速设为0 了流动相干了吸滤头没有放流动相液面之下流路中有大段气泡处理方法

15、：漏液：从泵的出口到柱子的前端接口 (柱后漏液几乎不会影响压力值) 顺次检查泵上有自己的漏液传感器。检测到漏液。会停止工作并蜂鸣，变红。同时显示错误信息：ERROR : LEAK DETECTED。发现漏液点，先停泵，重新接好。将漏 液擦干。有的漏液不明显， 这时压力的也不会太小， 检查时要注意， 可用手仔细摸各个接口，感觉是否湿冷。PURGE流路中有大段气泡：通过大流速(如 5ml/min )冲洗可以去除泵体内气泡。也就是常说的 按下泵的面板上的 purge 键即可。每次 PURGE 的时间和流速可以在面板上设定。 通常不改。初始值应该是 5ml/min ， 3min 。但有时候泵体内空气太

16、多， purge 都不可以，或者很难抽上流动相，这是可以在 purge 的同时，用注射器，在泵的废液出口处抽。直到没有气泡。 关于偶尔出现的气泡，不用太过在意，因为：1.有脱气机在。2.在 purge 时，由于流速太大，难免会出现气泡。尤其是在 purge 阀开超过 180 度，废液出口处出现气泡就跟平常了。3.只要气泡不在泵腔内堆积，就几乎不会影响到分析结果。只要出了泵口，在 高压下会被压缩的很小。不影响流路的延续性。 所以，只要观察压力变化，如果压力没有异常波动，就行。在泵体内有气泡堆积 时，压力波动会变大。什么样的波动算正常，需要大家注意观察。根究经验，在 以恒定流速，梯度不变时，面板上

17、以 MP 为单位的显示值应该几乎不变。频繁出现的气泡会影响到流路的延续性，应该注意。吸滤头堵，管路脏（通常是 水相）有可能带来频繁出现的气泡。可以先 A ，B 的溶剂瓶调换一下。 PURGE 五次。后换回来，再 PURGE 两次。清洗一下管路。压力过大 ：说明流路堵了 逐段排查，先从柱（预柱）前接口（因为柱子最易堵）断开，以一定流速走： 压力正常，说明是柱子及其后的某一段堵了（通常是柱子） 。换柱子（或预柱） 压力还高：说明是柱前某段堵了。这时再将进样器出口（接柱子）的 peek 管接头拧下： 压力正常：说明是这段 peek 管堵了。换 peek 管。 压力还高：说明是进样器之前的部分堵了。

18、通常是进样器六通阀堵了。 反冲或清 洗流通阀。其它部分依次类推。压力波动大 ：说明流路中的液流不平稳， 这时色谱图通常保留时间不稳定， 峰型 也不好。得到的线性，重复性也不会好。可能原因：泵体内有气泡，泵头单向阀坏。 先确认是哪一台泵有问题。先走 100%A 相。看是否压力还是波动大，还大则说 明 A 泵有问题。压力正常则说明 A 泵正常。再走 100% 的 B 相，过程如上。确认 好泵之后，先 purge 一下，以驱赶气泡。 Purge 两次后，还是压力波动大，这有 可能单向阀坏了，需要清洗或更换。Ctc 自动进样器的常用维护操作（实验室现场操作） 换针：调针位：调针位： 设定洗针体积： 一

19、些小概念：PEEK ：聚醚醚酮色谱管道，外径多为 1/16inch ，1inch=2.54cm ，1/16in=2.54cm ，内径大小以颜色 标准，红色（我们用的）最小，为 0.13mm （应该是国际统一标准）PEEK 接头手紧即可 不锈钢接头要用工具紧 接头分一体的和分为主体和压紧环两部分的。 后者在拧紧的过程中， 不易带动管 道扭曲变形。不锈钢的压紧环是一次性的单位换算： 1MPa=10bar=7500.6torr=14.5psi Psi ：pound per square inch （psi）Torr:托里彻利，标准大气压的 1/760。也就是mmHg （毫米汞柱） 其它问题：残留大:

20、可能由于流通阀堵塞，很可能是洗针过程有问题， 注意观洗针时有没有抽上液体， 多气泡。出现过由于转子磨损， 洗针液不能顺畅流出进样口 洗或更换转子 也可能进样过程有问题， 注意观察进样针活塞是否推到底。造成压力大，进样针没法推到底。重现性不好: 内标波动大，可能喷雾针脏了，使得喷雾不均匀。可能是液相方法没有开发好。 峰型差，峰太宽都有可能造成面积不重复（不会差别太大） 。注意观察重现性不好的那几针， 是否峰型比较特殊， 保留时间也有较大变化， 如 果是，很有可能是由于 pump 里进了气泡，造成流速不稳，这点可以从压力变化得 到确认，但是好像没法记录压力曲线。质谱检测器的色谱图：chromato

21、gram，强度和时间的图。等同于紫外检测的色谱 图。质谱检测器的光谱图：spectrum，某一时间点（段时间内平均）的强度相对质荷 比的图下图上半为一色谱图，下半部为图是灰色方块（ 2.5mi n左右）内，平均强度相对质荷比的光谱图。类似于紫外中的全波长图。:壯輩tT! m i 帀砂上邸1嶂 a r lew nA-tMi 曲W=1.70 Wi/ 2W1 / 2 =0.7 则 W=0.7*1.70=1.19差不多刚好实现单位质荷比的分离 线性范围：信号强度与样品浓度的关系可用如下关系式表示： R=ARCX 。R为信号强度大小，AR为响应因子。C为样品浓度，X为指数。X=1 ,表示在线性范围之内，考虑到 实验误差等因素。一般只要 X在0.98-1.92之间，就认为还在线性范围之内。线性范 围是一个浓度范围， 下限比较难测。 通常就以最小检测量或最小检测浓度作为线性 范围的下限。檢测限 叫人 样&试松检测器的线性范围