高三生物大一轮总复习第37讲微生物的培养与应用.docx
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高三生物大一轮总复习第37讲微生物的培养与应用
考点一 微生物的实验室培养
1．培养基
（1）概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
（2）种类：
液体培养基和固体培养基，二者的区别是是否添加凝固剂。
（3）营养成分：
①确定原则：
根据微生物的需要。
②主要营养物质：
碳源、氮源、水和无机盐。
③其他条件：
pH、特殊营养和氧气。
2．无菌技术
（1）目的：
获得纯净的培养物。
（2）关键：
防止外来杂菌的入侵。
（3）常用方法：
灭菌和消毒。
（4）无菌技术的主要方法及适用对象（连一连）
3．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
4．纯化大肠杆菌
（1）原理：
在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。
（2）主要方法及纯化原理：
5.菌种的保藏方法
（1）临时保藏法：
对于频繁使用的菌种，先接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后放入4℃的冰箱中保藏。
（2）甘油管藏法：
对于需要长期保存的菌种，先将菌液转入灭菌后的甘油中，混匀后放在－20℃冷冻箱中保存。
（选修1P18“旁栏小资料”）微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？
微生物接种的核心是什么？
提示：
不是，微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法，其核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。
【误区警示】
微生物培养的“三个提醒”
（1）培养基中营养物质的确定方法
①自养型微生物所需的主要营养物质是无机物，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。
②异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
（2）选择无菌技术的原则
①考虑无菌技术的效果：
灭菌的效果比消毒要好。
②考虑操作对象的承受能力：
活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能灭菌。
（3）纯化大肠杆菌的两种方法的异同。
①相同点：
平板划线法和稀释涂布平板法都能获得单细胞菌落。
②不同点：
平板划线法不能对微生物计数，而稀释涂布平板法能对微生物计数。
1．（2019·新课标全国卷Ⅰ）某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。
回答下列问题：
（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________。
能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是____________________________________________________。
但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是__________________________________________________（答出两点即可）。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________________。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有____________________________________（答出两点即可）。
【解析】
（1）能分解尿素的细菌体内应含有脲酶；能分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物，可用葡萄糖等有机物作为碳源。
进入细菌体内的葡萄糖既能为细胞生命活动提供能量，又可为其他有机物的合成提供原料。
（2）筛选可分解尿素的细菌，应选择以尿素为唯一氮源的培养基，而能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，其他两组不能起到筛选作用。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，这两种物质既可为细菌生长提供无机营养，又可作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH相对稳定。
【答案】
（1）脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料
（2）尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
（3）为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
2．（2019·新课标全国卷Ⅰ）空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。
某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。
实验步骤如下：
①配制培养基（成分：
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
（1）该培养基中微生物所需的氮来源于____________。
若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。
（2）步骤③中，实验组的操作是______________________。
（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。
若将30（即36－6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________（填“正确”或“不正确”）。
【解析】
（1）培养基中的牛肉膏和蛋白胨可为培养基中的微生物提供氮源；制备固体培养基需加入琼脂。
（2）该实验的目的是了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况，所以需在教室不同高度的位置分别用平板收集微生物即开盖暴露一段时间。
（3）该实验中空白对照组不应出现菌落，若空白对照组出现了菌落，则说明此次调查中出现了污染现象，实验组的污染情况不能确定，故不能用实验组与空白对照组菌落数的差值作为实验结果，而应重新进行实验。
【答案】
（1）牛肉膏、蛋白胨 琼脂
（2）将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间
（3）污染 不正确
【解题归纳】
培养基中的“碳源和氮源”比较
考点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．筛选菌株
（1）寻找目的菌株的原则：
根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
（2）实验室筛选尿素分解菌的方法：
使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养。
（3）选择培养基：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．微生物的计数
3.实验流程及注意事项
4．分解尿素的细菌的鉴别
（1）方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。
（2）原理：
（3）实验现象及结论
①培养基变红：
该种细菌能分解尿素。
②培养基不变红：
该种细菌不能分解尿素。
5．设置对照和重复
（选修1P26“旁栏小资料”）细菌数目的测定还有哪些方法？
举例说明。
提示：
滤膜法。
测定饮用水中大肠杆菌的数目可以采用滤膜法。
3．（2019·新课标全国卷Ⅲ）某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。
分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。
回答下列问题：
（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用______________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是____________________________
__________________________________________________________。
（2）推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有______________和______________。
分离纯化时应挑选出______________的菌落作为候选菌。
（3）乳酸菌在－20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的______________（填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”）。
【解析】
（1）分离纯化乳酸菌时，由于泡菜滤液中菌的浓度高，因此需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，其目的是将聚集在一起的乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单菌落。
（2）乳酸菌代谢过程中可产生乳酸，若在培养基中加入碳酸钙，则碳酸钙既可以中和乳酸，又可以在乳酸菌菌落的周围出现明显透明圈，据此可以用于乳酸菌的鉴别。
（3）乳酸菌在－20℃长期保存时，为了避免水结冰产生冰晶损伤细胞，在菌液中常需要加入一定量的甘油。
【答案】
（1）无菌水 泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落
（2）鉴别乳酸菌 中和产生的乳酸（或酸） 具有透明圈
（3）甘油
4．大肠杆菌的纯化包括制备牛肉膏蛋白胨培养基和纯化大肠杆菌两个环节，试分析回答：
（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑________、________和渗透压等条件。
（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行________（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和________；空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能________________。
（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的________________________。
（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的________________。
（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。
对于固体培养基应采用的检测方法是_______________________________
__________________________________________________________。
【解析】
（1）微生物的培养条件有适宜的营养物质（碳源、氮源、水、无机盐和生长因子等）、温度、pH、渗透压（控制培养液的浓度）等。
（2）在微生物实验操作中，防止杂菌污染是贯穿整个实验过程中的内容，因此，对环境、生物材料、操作者双手等进行清洁和消毒，对培养基、接种环和培养仪器进行灭菌等是微生物实验中的常见操作。
紫外线灭菌的原理是紫外线使蛋白质和DNA等生物大分子空间结构改变而导致变性。
（3）稀释涂布平板法是细菌分离纯化与计数的常用方法，合理的稀释倍数与培养基上长出的菌落数目直接相关，只有合适的稀释倍数，平板上才能得到单细胞菌落，才能得到菌落数为30～300的平板，以进行微生物的计数。
（4）微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落，依据菌落大小、形态、色泽等可以对细菌进行初步鉴定或分类。
（5）检测培养基是否被污染的方法是将空白培养基放在适宜温度条件下，若长出菌落，说明培养基被污染，只有培养基上不出现菌落时才是合格的。
【答案】
（1）温度 酸碱度
（2）灭菌 消毒 损伤DNA的结构
（3）比例合适 （4）鉴定（或分类）
（5）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生
考点三 分解纤维素的微生物的分离
1．纤维素与纤维素酶
（1）纤维素：
一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。
（2）纤维素酶：
①组成：
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶三种组分。
②作用：
2．纤维素分解菌的筛选
（1）方法：
刚果红染色法。
（2）培养基：
富含纤维素的选择培养基。
（3）筛选原理：
（4）菌落的挑选：
挑选产生透明圈的菌落。
3．实验流程及注意事项
【误区警示】
（1）纤维素分解菌的选择培养基中并不只有纤维素一种碳源。
（2）纤维素分解菌的选择培养基上生长的并不只是纤维素分解菌。
（3）纤维素分解菌菌落周围的透明圈的大小与纤维素分解菌分解纤维素的能力呈正相关。
5．（2019·新课标全国卷Ⅰ）植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。
回答下列问题：
（1）分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。
（2）在含纤维素的培养基中加入刚果红（CR）时，CR可与纤维素形成__________色复合物。
用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
（3）为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基（成分见下表）：
注：
“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲________（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是______________________；培养基乙________（填“能”或“不能”）用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_____________________________________________________。
【解析】
（1）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分：
C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
（2）刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
用含有刚果红的纤维素培养基培养纤维素分解菌时，由于纤维素被分解，红色复合物无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
（3）培养基甲未使用琼脂，为液体培养基，不能用于分离单菌落。
含有纤维素和刚果红（CR）的培养基可分离和鉴别纤维素分解菌。
【答案】
（1）纤维二糖 葡萄糖
（2）红 透明圈
（3）不能 液体培养基不能分离单菌落 不能 培养基乙中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
6．（2019·湛江模拟）随着环境污染的加剧和石油危机出现，越来越多的国家开始选择使用乙醇作为代替燃料，生产中玉米和麦草的秸秆可以用来生产燃料乙醇。
已知秸秆的主要成分是纤维素，回答下列问题：
（1）人们首先利用纤维素分解菌将纤维素分解，纤维素分解菌多分布在________的土壤中，该微生物产生的纤维素酶是一种复合酶，一般包括三种成分：
________，________和________。
前两种酶能使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
（2）从土壤中筛选纤维素分解菌需要配制________培养基，该培养基中需要加入纤维素粉作为________。
（3）经过梯度稀释后，要将样品均匀涂布在用于鉴别纤维素分解菌的培养基上，在该培养基中需要加入的特殊染料是________，当形成菌落以后可以根据菌落周围是否产生________来筛选纤维素分解菌。
（4）在利用涂布器涂布平板之后，需要对涂布器进行________（填“消毒”或者“灭菌”）处理。
【解析】
（1）纤维素分解菌多分布在富含纤维素的土壤中，纤维素酶包含三种成分：
C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。
（2）筛选纤维素分解菌的培养基为选择培养基，其中添加的纤维素粉是由C、H、O三种元素组成的多糖，只能为微生物提供碳源。
（3）鉴别纤维素分解菌时要在培养基中添加刚果红作为指示剂，刚果红能与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素分解菌分解后，红色复合物就不能形成，其菌落周围就会产生不变红的透明圈。
（4）微生物接种工具在接种前和接种后均要进行灭菌处理。
接种前灭菌的目的是防止杂菌污染，接种后灭菌的目的是防止微生物污染环境或感染操作者。
【答案】
（1）富含纤维素 C1酶 Cx酶 葡萄糖苷酶
（2）选择 碳源 （3）刚果红 透明圈 （4）灭菌
[构建知识网络]
[必背答题语句]
1．无菌操作技术包括消毒和灭菌，消毒包括煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒和紫外线消毒等；灭菌包括灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。
2．培养基的制备包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板等步骤，倒置平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。
3．大肠杆菌的纯化包括平板划线法和稀释涂布平板法。
平板划线法要求多次划线，稀释涂布平板法要求菌液要充分地稀释。
4．微生物的计数要求制作多个平板，且每个平板上能长出30～300个菌落。
5．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。
练真题[感悟高考 展示规律]
1．（2019·江苏卷）苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。
小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。
请回答下列问题：
（1）酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有________。
（2）将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。
若上图平板中菌落过于密集，应进一步________，以便于菌落计数与分离。
制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。
（3）如图为连续划线法示意图，在图中________（填图中序号）区域更易获得单菌落。
（4）采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。
先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为________。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度（mg/L）
1
如果废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释__________（填序号：
①5 ②10 ③20）倍后，再进行比色。
解析：
本题考查微生物分离的相关知识。
（1）酚降解菌培养基中的蛋白胨和苯酚为酚降解菌生长提供碳源。
（2）转接的目的之一是富集降解苯酚能力强的酚降解菌，随转接次数增多，培养基中的苯酚含量应逐渐增加。
若平板中菌落过于密集，则需进一步稀释，降低菌体密度后再涂布培养，以便于菌落分离与计数。
制备平板培养基时，需添加琼脂等凝固剂。
（3）连续划线时，在划线的末端菌体密度最低，即在划线的末端最易获得单菌落。
（4）1号比色管应为空白对照组，由6号比色管中苯酚浓度知，2～5号比色管苯酚浓度应为0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L。
废水为50mg/L苯酚溶液，降解后残留的苯酚浓度约为50×21%＝10.5（mg/L），则需对残留液进行20倍稀释后[10.5÷20＝0.525（mg/L）]，才可以进行比色。
答案：
（1）蛋白胨、苯酚
（2）增加 稀释涂布 凝固剂
（3）③ （4）0、0.2、0.4、0.6、0.8 ③
2．（2019·四川卷）图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
（1）图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。
（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。
突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。
解析：
（1）脲酶由分解尿素的细菌产生，故需用以尿素为唯一氮源的培养基筛选该类微生物。
分解尿素的细菌合成的脲酶可以将尿素分解成氨，故培养基中加入酚红指示剂后，菌落周围将出现红色。
（2）稀释涂布平板法常用来统计样品中的活菌数，在计数时一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。
每克样品中的菌株数＝（C/V）×M。
因培养基上两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故统计结果往往较实际数目少；而用血细胞计数板计数时，死亡的、活的菌体都计数在内。
（3）乙图显示，mRNA在箭头以前有273个核苷酸（为91个密码子），箭头处增加的70个核苷酸与后续的AG刚好组成24个密码子，后面的UGA为终止密码。
突变基因表达的蛋白质含91＋24＝115（个）氨基酸。
答案：
（1）尿素 酚红 红
（2）稀释涂布平板法 1.75 少
（3）UGA 115
3．（2019·新课标全国卷Ⅰ）已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。
脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。
回答有关问题：
（1）显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用____________染色。
微生物A产生的油脂不易挥发，可选用____________（填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”）从菌体中提取。
（2）为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以____________为碳源的固体培养基进行培养。
（3）若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用____________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用____________法进行计数。
（4）为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35℃、40℃、45℃温度下降解10g油脂所需酶量依次为4mg、1mg、6mg，则上述三个温度中，__________℃条件下该酶活力最小。
为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕____________℃设计后续实验。
解析：
本题主要考查了植物油脂的染色和提取方法、选择培养基的配制、微生物的计数以及确定酶的最适温度的实验设计等。
（1）脂肪可用苏丹Ⅲ染液（或苏丹Ⅳ染液）进行染色。
微生物A产生的油脂不易挥发，不能用水蒸气蒸馏法提取，应用萃取法加以提取。
（2）能产生脂肪酶的微生物B可存在于含有油料作物种子的腐烂物的土壤中，为了选择培养，固体培养基上应以油脂作为唯一碳源。
（3）测定培养液中的微生物的菌体数，可在显微镜下用血细胞计数板直接计数；而要测定活菌数，则可利用稀释涂布平板法进行计数。
（4）酶量需要最多的温度下，其酶活力最小，即酶活力最小的温度应为45℃。
三个温度下酶活力最大的温度是40℃，但40℃不一定是该酶的最适温度，故应围绕40℃设计后续实验。
答案：
（1）苏丹Ⅲ（或苏丹Ⅳ） 萃取法
（2）油脂
（3）血细胞计数板 稀释涂布平板 （4）45 40
4．（2019·江苏单科）人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。
为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。
请回答下列问题：
（1）在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是________（填序号）。
①酒精灯 ②培养皿 ③显微镜 ④无菌水
（2）在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是_______________________________________________________。
（3）向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是_________________________________。
（4）刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落（如图）。
图中降解圈大小与纤维素酶的________有关。
图中降解纤维素能力最强的菌株是________（填图中序号）。
（5）研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果如下图，推测
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