ChIP实验精讲做科研的必看.docx

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ChIP实验精讲做科研的必看

染色质免疫共沉淀（ChIP）

概述

ChIP：

chromatinimmunoprecipitationassay，染色质免疫沉淀技术。

研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。

ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法

原理

在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP应用

1、检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系；

2、CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；

3、CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；

4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术

1.细胞甲醛交联和收集

注意事项：

①需要优化甲醛使蛋白质和DNA交联的时间。

②交联的时间很关键。

交联的时间一般为2-30分钟。

③交联过度会降低抗原的可结合性和超声的效率，也会被遮盖抗原的表位。

④甘氨酸可抑制甲醛的作用，终止交联反应。

1.1取1直径10cm培养皿的细胞。

加入甲醛至终浓度为0.75%（V/V），使蛋白和DNA交联。

1.2室温下，轻摇10分钟。

1.3加入甘氨酸至终浓度为125mM，室温下放置5分钟，以终止交联。

1.4吸去培养基，用冰冷PBS洗细胞2次。

1.5使用细胞刮刀，加入5ml冰冷PBS，刮下细胞，收集至一个50ml离心管中。

1.6再用3ml冰冷PBS洗培养皿2次，至50ml离心管中。

1.74℃，1000g，离心5分钟收集细胞。

1.8吸弃上清，用SDSLysisBuffer重悬沉淀（每1X107个细胞加800μl）。

SDSLysisBuffer配方：

50mMHEPES-KOHpH7.5

140mMNaCl

1mMEDTApH8

1%TritonX-100

0.1%SodiumDeoxycholate

0.1%SDS

ProteaseInhibitors（每次新鲜加入）

注意事项：

使用悬浮细胞实验时，加入0.75%（v/v）的甲醛和甘氨酸后，5分钟，1000g

离心沉淀细胞。

冰冷PBS洗3次，用SDSLysisBuffer重悬细胞（每1X107细胞加800μl）。

2.组织免疫沉淀样品的制备

注意事项：

①每个IP反应建议使用肝组织30mg，可按实际情况调整。

②每种组织的用量依据组织蛋白丰度、抗体亲和力和交联效率而定。

③每个IP反应最适染色质的量为5-15μg。

④每次交联免疫沉淀反应之前，需根据不同组织类型确定具体的染色质需要量。

⑤所有溶液中均应添加蛋白酶抑制剂proteininhibiter（cocktail）。

2.1.交联反应

注意事项：

①冰冻组织应置于冰上融化。

②冰冻组织融化时温度不能过高，以免蛋白酶活化使组织降解。

③操作过程中要一直在冰上进行，尽量缩短操作时间防止蛋白降解。

2.1.1.将冰冻或新鲜组织切成小块（1-3mm3）。

2.1.2.取一个空的15ml离心管，称重，放入组织后再次称重，计算组织重量。

2.1.3.每克组织加10mlPBS。

加入终溶度1.5%（v/v）的甲醛，室温旋转15分钟。

2.1.4.加入甘氨酸至终浓度0.125M，终止交联反应，室温旋转5分钟。

2.1.5.4°C，720rpm，离心5min。

2.1.6.弃上清，用加入10ml预冷的PBS洗涤。

4°C，720rpm，离心5min，弃上清。

注意事项：

①所得组织可用液氮速冻，保存于-80°C。

②避免反复冻融。

③使用时可用预冷PBS重悬组织，每克组织加10ml，置冰上解冻。

2.2.降解组织

2.2.1.剪掉1ml枪头的末端，使吸头口增大。

2.2.2.用1mlPBS重悬50-100mg组织。

2.2.3.将溶液加入锥形研磨管中，研磨2分钟。

2.2.4.用1ml注射器连接18号钝圆针头，插入研磨管中收集细胞。

将细胞加入一个锥形管中，冰上放置。

2.2.5.显微镜下观察细胞悬液，以确定得到的是单细胞悬液。

2.2.6.1000rpm,4°C，离心10分钟收集细胞。

2.2.7.弃上清，用SDSLysisbuffer重悬沉淀（每1x107个细胞加入800μl）。

2.2.8.超声处理。

3.超声

3.1超声处理裂解液，将DNA打断成500-1000bp范围内的片段。

注意事项：

①使用组织进行实验时，要得到单细胞悬液，需从超声处理开始。

②细胞系不同，需要超声的时间也不同，需要分别优化得到最佳条件。

③取部分样本使用1.5%（质量百分比）的琼脂糖凝胶电泳，分析超声结果。

33.2超声处理后，4°C，10，000g，离心10min，以除去细胞碎片。

转移上清至新管中。

3.3超声后的样本各取50μl，测量DNA浓度，用为PCR对照。

注意事项：

①超声后溶液可在液氮中速冻，可于-80°C保存2个月。

②避免反复冻融，以免样品降解。

③超声时间过长会使核小体与DNA的交联断裂，一般超声时间为15min。

4.纯化DNA4.1试剂盒纯化DNA

①加入2μlRNA酶A（0.5mg/ml）。

②65°C，4-5小时（或过夜），解交联。

③按照DNA纯化试剂盒说明书纯化DNA。

④样本可于-20°C保存。

注意事项：

使用DNA纯化试剂盒纯化DNA时，应加入RNA酶A处理样品，以免RNA浓度过高减少DNA的最终纯化量。

4.2酚:

氯仿抽提纯化DNA

①加入5μl蛋白酶K（20mg/ml）。

②65°C，4-5小时（或过夜），解交联。

③等体积酚:

氯仿抽提DNA样品3次。

④取水相加入10μl糖原（5mg/ml），2倍体积无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥10min。

⑤加入100μl水溶解沉淀。

⑥样本可于-20°C保存。

注意事项：

使用蛋白酶K消化样品，可以水解蛋白质，使蛋白质与DNA解交联，以促进DNA的纯化。

4.3DNA浓度测定

①取5μl纯化DNA，稀释200倍，测定OD260。

②DNA浓度（μg/ml）=OD260x10,000，计算DNA浓度。

5.免疫沉淀

5.1.使用超声处理所得溶液进行免疫沉淀反应。

建议：

①沉淀反应DNA含量约为25μg。

②每个样本用RIPA缓冲液稀释10倍。

③设一个抗体对照和一个仅加磁珠（不加抗体）的对照。

RIPAbuffer配方：

50mMTris-HClpH8

150mMNaCl

2mMEDTApH8

1%NP-40

0.5%SodiumDeoxycholate

0.1%SDS

ProteaseInhibitors（每次新鲜加入）

5.2.样本中均加入一抗（对照样品不加）。

注意事项：

①先进行预实验得到最佳的抗体加入量。

②每25μgDNA一般加入1-10μg抗体。

5.3.样品中加入20μl的proteinA/G磁珠，免疫沉淀（IP），4°C，缓慢旋转过夜。

5.4.2000g离心1min收集磁珠，弃上清。

5.5.用1ml低盐washbuffer洗涤磁珠3次。

2000g离心1分钟。

低盐Washbuffer配方：

0.1%SDS

1%TritonX-100

2mMEDTApH8

150mMNaCl

20mMTris-HClpH8

5.6.用高盐washbuffer洗1次。

2000g离心1分钟。

高盐washbuffer配方：

0.1%SDS

1%TritonX-100

2mMEDTApH8

500mMNaCl

20mMTris-HClpH8

注意事项：

①如果背景过高，则应增加洗涤次数。

②超声处理后的染色质先与proteinA/G磁珠共孵育1小时，将消除与磁珠的非特异行结合，降低背景。

6.免疫复合物洗涤和解交联

6.1回收DNA：

向proteinA/G磁珠中加入120μlExtractionbuffer，30°C，旋转15分钟。

Extractionbuffer配方：

1%SDS

100mMNaHCO3

6.22000g离心1分钟。

将上清转移至新管中。

样本可于-20°C保存。

6.3.纯化DNA可用DNA纯化试剂盒或酚:

氯仿抽提进行（参照上面步骤）。

6.4.DNA可用Realtime-PCR进行定量检测。

2、ChIP常见问题

1.ChIP是什么？

答：

染色质免疫沉淀技术（ChromatinImmunoprecipitation，简称ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。

它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。

2.ChIP有哪些应用？

答：

近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用；从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。

3.ChIP技术的原理？

答：

生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。

染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及DNA的鉴定。

因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。

4.做ChIP试验，必须做甲醛固定么？

答：

不一定，视样品及试验方案而定。

做甲醛固定的为X-ChIP，而不需要固定的为N-ChIP。

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。

甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。

甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

5.为什么必须将DNA切碎至少于1000bp大小（大约3个核小体~400-500bp）?

答：

为确保ChIP实验有良好精度。

若您的平均片段长度大于1000bp，您将会分离获得包含您目标序列的DNA，但所要研究的蛋白会离您目标序列有700个核苷酸的距离。

6.为什么使用鲑鱼精子DNA来封闭琼脂糖珠子？

为什么我的样品中鲑鱼精子DNA不会发生PCR反应？

答：

鲑鱼精子用于降低降低染色质DNA与琼脂糖珠子的非特异性结合。

实验者不太可能对鲑鱼组织做ChIP实验，所以此DNA不会因交叉杂交而被PCR引物扩增。

7.引物最佳设计是什么样的？

答：

引物长度应为24个核苷酸，应含有50%GC碱基对，Tm值为60°C。

不要扩增大于600-800个核苷酸的序列。

不必考虑基因组内不独一序列。

8.您推荐下如何从琼脂糖（或琼脂糖凝胶）中洗脱抗体-蛋白-DNA复合物，用来做re-ChIP试验？

答：

在ChIP分析试剂盒内可找到洗脱缓冲液，用它洗脱复合物。

对于re-ChIP，有必要添加蛋白酶抑制剂到免疫沉淀洗液和洗脱缓冲液，及第二轮实验用的稀释缓冲液。

请确定所有溶液处于低温，蛋白质不会因此而在收集第一次免疫沉淀的复合物或第二次免疫沉淀时降解。

9.蛋白A琼脂糖能被用于小鼠IgM?

答:

蛋白质A不能与小鼠IgM结合。

可以考虑用一个桥接抗体连接。

10.在做ChIP之前，有办法纯化细胞核么？

答:

在细胞与甲醛交联后，细胞核可通过“溶胀缓冲液”培育及剪刀细胞均质器（douncehomogenization）制备（至少10倍体积）。

溶胀缓冲液：

25MHepes,pH7.8

1.5mMMgCl2

10mMKCl

0.1%NP-40

1mMDTT

0.5mMPMSF

蛋白酶抑制剂混合剂

然后按照protocol在SDS裂解液中裂解

11.ChIP超声波的最佳条件？

答:

1.确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。

不要震荡或者摇晃裂解物，避免有气饱（气泡产生）。

超声波仪会替你做这些。

2．脉冲应在~10秒（与体积一致）。

3.样品量小于400uL间隔应大于1分钟，在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。

4.避免泡沫。

请确定超声探头靠近液体底部（不能让探头碰到管壁）。

5．若发现泡沫，立即停止超声，置于冰上。

旋转EP管以去除泡沫，继续超声。

6.在按“开始”键之前将探头置于液体中。

12.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么？

答:

是，实际上比起全细胞，细胞核更好。

我们用全细胞裂解物，因为它更简便，通常也能得到好结果。

此页有一些相关信息：

13.我是否可以改变逆转交联的时间和温度?

答：

并不推荐少于4个小时的逆转交联.但是,可以将样本在65度过夜逆转交联.需要注意的是,样品不能干掉。

14.做组蛋白ChIP时,什么时候不需要交联?

答：

nativeChIP中,HistoneH3andHistoneH4都不需要交联反应,因为它们本身来说和DNA结合的非常紧密.组蛋白H2A和H2B并不是紧密联接,但是在nativeChIP中依然可以不需要交联反应。

15.什么是inputDNA?

OutputDNA?

答：

从染色质上获得的未做过IP的已经被逆转交联的DNA.它是检查PCR是否有效的对照。

OutputDNA是来自每次IP实验的DNA.

其实就是genomicDNA.在ChIP实验中,sonication或酶解后,样本取部分不做IP,直接逆转交联.它的最主要的作用就是检查PCR系统是否work.通常情况下,在该条道中,都可以看到条带的.如果没有,说明PCR系统不work。

16.通过改善交联是否能提高ChIP的enrichment?

答：

Notlikely.Formaldehydeisaveryreactivedipolarcompoundinwhichthecarbonatomactsasanucleophiliccenterforaminoandiminogroupsofaminoacids（Lys,Arg,andHis）andofDNA（primarilyAandC）,leadingtotheformationofaSchiffbase.Thisintermediatecanfurtherreactwithasecondaminogroup,resultinginthefinalDNA–proteincomplex1-3.Yourprotein,ortheprotein-DNAcomplex,alsocrosslinkwithotherproteinsandlipids,viathesamemechanism,.Increasingformaldehydeconcentrationand/ortheincubationtimemayadverselyaffectimmunoprecipitation.Itisrecommendedthatyouoptimizeotherpartsoftheprotocolforimprovement.

17.如何来量化经IP后的DNA?

答：

DNApurifiedfromChIPexperimentscanbequantitatedbyPCR,providingtheamplifyingoligosmeetspecificcriteria.Oligosshouldbe24mers,withaGCcontentof50%（+/-4）andaTmof60.0C（+/-2.0）.YoumustbecertainthatthePCRreactionsarewithinthelinearrangeofamplification.Generallyittakestimetoachievethis.ToomuchinputDNAwillaffectyourresults,sosetupseveraltubesforeachexperimenttooptimizetheinputDNA.Generally,thisisabout1/25thto1/100thforyeast,approximately1/10formammaliancells,butdependsontheamountofantibodyandinputchromatin.Also,donotusemorethan20cycles,makingsurethatdNTP'salwaysremaininexcess.Also,includeeachreactionacontrolprimer（tocompareyourexperimentalbandagainst-makesurethesizesaresufficientlydifferenttoallowproperseparation-75basepairsisusuallyOK）settoaregionofthegenomethatshouldnotchangethroughoutyourexperimentalconditions.AlsoPCRfrompurifiedinputDNA（noChIP）andincludenoantibodycontrolPCR'saswell.PCRproductsshouldbenomorethan500basepairsandshouldspantheareaofinterest（whereyouthinkyouwillseechangesinacetylationormethylationofhistones）.AllPCRproductsshouldberunon7-8%acrylamidegelsandstainedwithSYBRGreen1（MolecularProbes）atadilutionof1:

10,000（in1XTris-borate-EDTAbuffer,pH7.5）for30minutes-nodestainingisrequired.QuantitationiscarriedoutsubsequenttoscanningofthegelonaMolecularDynamicsStorm840or860inBluefluorescencemodewithPMTvoltageat900withImageQuantsoftware.Thishasdistinctadvantagesoverethidiumbromidestaining.SYBRGreenismuchmoresensitive,andilluminationofethidiumstainedgelscanvaryacrossthegelbasedonthequalityofUVbulbsinyourinyourlightbox.Forfurtherinfo,seeStrahl-Bolsingeretal.（1997）GenesDev.11:

83-93.AradioactivequantitationmethodisdescribedinSukaetal（2001）Molec.Cell,8:

473-479.

18.为什么ChIP试验需要用经验证的抗体？

答：

抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的，有的抗体识别的抗原表位比较小，不容易暴露，在ChIP实验中容易被DNA包裹，从而使抗体无法结合，因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的，商业化的抗体都应该是验证过的。

19.如何确保在最大功率下超声裂解不起泡

答：

1.UsethevolumeofSDSlysisbufferyouchoose,coolonice

2.Startsonicationwithincreasingpoweruntilfoamingoccurs.

3.Lowerthepoweralittle.Thisisthepoweryoucanuse（forinstance,ifitstartsfoamingat40%,then35%shouldbeOK）.

4.Cooltheabovevialandsonicateforonepulse.Touchthevialwithoutgloveanditshouldnotbehot（warmisOK）,otherwiseshortenthetime（10-15secondsaregenerallyused）.

5.Preparecellsinlysisbufferandsonicatefor3,6,9（orwhateveryouprefer）pulsesandcheckDNAongel.

Otherthingstowatchout:

Load~1x10^5cellequivalent（Thisis<0.7ugDNA）/Lane.

Make