本科毕业设计大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析.docx
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本科毕业设计大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析
硕士学位论文
大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析
张文杰
指导教师
章元明教授
专业名称
作物遗传育种
研究方向
大豆耐逆遗传与生物统计
答辩日期
2012年6月
Evaluationandassociationmappingforsoybeansalt-alkalinetoleranceatseedingstage
By
ZhangWenjie
TheThesisSubmittedto
NanjingAgriculturalUniversity
NanjingP.R.China
InPartialFulfillmentoftheRequirements
for
TheMasterDegree
Supervised
By
Prof.ZhangYuan-Ming
CompletedinJune2012
原创性声明
本人郑重声明：
所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者（需亲笔）签名：
年月日
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本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。
保密□，在年解密后适用本授权书。
本学位论文属于不保密□。
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年月日
导师（需亲笔）签名：
年月日
大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析
摘要
土壤盐碱化是世界范围内影响农作物生产的主要非生物胁迫因子，同时也是降低作物产量的主要因子。
全世界大概有20%的农业灌溉用地受到盐碱的影响。
近年来，由于不合理农业灌溉进一步加重了耕地盐碱化。
为保持大豆在盐碱化土壤环境的持续生产，培育新品种是一种有效途径。
然而，其先决条件是解析大豆耐盐碱性的遗传机制。
大豆耐盐碱性遗传研究主要是利用双亲分离群体，其结果对作物育种贡献有限。
为克服这一缺陷，利用品种资源群体进行关联分析是一种有效的方式。
为此，本研究以分层随机抽样方法抽取的257份大豆品种为研究材料，在大豆幼苗期分别以浓度为100mM的NaCl溶液和10mM的Na2CO3溶液作为盐、碱处理液，以蒸馏水处理作为对照，大豆幼苗期主根长、下胚轴长、根鲜重、根干重和幼苗生物量的表型值以及各性状的耐盐、碱指数为指标，鉴定各大豆品种的耐盐碱性；利用135个SSR标记扫描该品种群体获得分子标记数据，通过上位性关联分析方法（EAM）和两种改进的压缩混合线性模型方法（ECMLMA和ECMLM）进行大豆耐盐碱性的关联分析；利用关联分析结果，发掘优异等位基因与载体品种，并实施设计育种。
其主要结果如下：
1、以大豆幼苗期根鲜重耐盐和耐碱指数为指标，鉴定出两年表现基本一致、重复性好的耐盐品种2个：
枫紫田岸豆和白秋1号；鉴定出耐碱品种8个：
临安八月白、嵊县田埂豆、遵义棕子豆、北川乌眼窝、枫紫田岸豆、广西大粒豆、合豆6号和冀豆13。
枫紫田岸豆既耐盐又耐碱。
2、以耐盐碱指数为指标，通过ECMLM方法检测到129个QTLs，其中主根长、根鲜重、根干重、下胚轴长和幼苗生物量分别有35、24、19、33和18个；通过EAM方法共检测到154个QTLs，其中主根长、根鲜重、根干重、下胚轴长和幼苗生物量分别有28、31、22、33和40个。
两种方法共同检测到30个QTLs，以QTL×环境互作为主，贡献率为0.68%-9.38%。
以原始观测值为指标，通过ECMLMA、ECMLM和EAM方法共同检测到20个QTLs，其中主根长、下胚轴长、根干重和根鲜重分别有6、10、1和3个。
上述两种结果间既有相同的QTL，又有一定的互补性。
本研究获得的大豆耐盐碱性部分关联标记与拟南芥耐盐基因的大豆同源基因连锁，例如satt453、satt656、satt411、satt687、satt256、satt413、sat_153、satt672和satt102。
3、利用关联分析结果，估计各QTL的等位基因效应，挖掘优异等位基因与载体品种，例如，主根长耐盐与耐碱指数减效最大的等位变异分别为353bp（sat_256）和401bp（sat_344），其载体品种分别为德兴老鼠牙和徐豆10号。
发现白秋1号和北川乌眼窝均携带耐盐、耐碱的优异等位变异，具有育种利用价值。
关键词：
大豆；耐盐碱性；抗性鉴定；关联分析;优异等位基因
EvaluationandassociationmappingforSOYBEANsalt-alkalinetoleranceATseedingstage
ABSTRACT
Soilsalinizationisanimportantabioticstressforcropproductionworldwide,andseriouslyreducedcropyieldaswell.About20%oftheagriculturalirrigationlandwasaffectedbysaltandalkaline.Inrecentyears,soilsalinizationismoreandmoreseriousowingtounsuitableirrigation.Tomaintainasustainableproductionofsoybeaninasaltstressenvironment,developingalkaline-salttolerantcultivarsisanefficientway.However,theprerequisiteforthebreedingistoelucidategeneticmechanismofthetolerance.
Previousstudiesonsoybeanalkaline-salttolerancefocusonbi-parentalsegregationpopulations,anditsresultshavealimitedroleincropbreeding.Toovercometheshortcoming,analternativeapproachistoconductgenome-wideassociationstudies（GWAS）ininsoybeancultivarresource.Inthisstudy,therefore,257soybeancultivarsrandomlyselectedfromChina,alongwith135SSRmarkerinformation,wereusedtocarryoutGWASforthetoleranceusingenrichedcompressionmixedlinearmodel（ECMLM）andepistaticassociationmapping（EAM）approaches.Evaluationofsoybeanalkaline-salttolerancewascarriedoutbasedonlengthofmainroot（LR）,freshanddryweightsofroots（FWRandDWR）,biomassofseedlings（BS）andlengthofhypocotyls（LH）forhealthyseedlingsaftertreatmentswithcontrol,100mMNaCland10mMNa2CO3foraboutoneweekundergreenhouseconditions.UsingresultsfromGWAS,geneticeffectsofalltheallelesforeachlocuswereestimatedsothatelitealleleanditscultivarcouldbefoundandbreedingbydesigncouldbeperformed.Themainresultswereasdfollows.
First,usingFWRindexatseedlingstage,twocultivars（Zifengtian’andouandBaiqiuNo.1）haveastablesalinetolerantperformance,andeightcultivars（Lin’anbayuebai,Shengxiantiangengdou,Zunyizongzidou,Beichuanwuyanwo,Zifengtian’andou,Guangxi-dalidou,HedouNo.6andJidouNo.13）haveastablealkalinetolerantperformancein2009and2010.NotethatZifengtian’andouhastheabovetwoperformancessimultaneously.
Second,withalkaline-salttolerantindices,atotalof129main-effectQTL:
35forLR,24forFWR,19forDWR,33forLHand18forBS,weredetectedbytheECMLMmethod,whereasatotalof154QTL:
19forLR,27forFWR,18forDWR,26forLHand32forBS,wereidentifiedbytheEAM.Itshouldbenotedthatthereare30commonQTLwiththeheritabilitiesof0.68%-9.38%,whicharemainlyQTL-by-environmentinteraction.Withoriginalobservationsforthealkaline-salttolerance,20commonQTL:
6forLR,10forLH,1forDWRand3forFWR,wereidentifiedbyECMLMA,ECMLMandEAMapproaches.SomesameQTLwereobservedbetweentheabovetwokindsofresults.
Moreimportantly,somealkaline-salttolerancegenesinArabidopsisthalianaandsoybeanarefoundtobearoundthetolerance-associatedmarkersinthisstudy,i.e.,satt453,ofsatt656,satt411,satt687satt256,satt413sat_153,satt672,andsatt102.
Finally,theaboveresultsfromGWASwereusedtoestimatealleliceffectssothatnovelalleleanditscultivarcouldbemined,forexample,eliteallelesforLRalkaline-salttoleranceindiceswere353bp（sat_256）and401bp（sat_344）andtheircorrespondingcultivarswereDexinlaoshuyaandXudouNo.10.NotethatBaiqiuNo.1andBeichuanwuyanwohavethetolerancetosaltandalkalinestressessimultaneously,whichareofuseinsoybeanbreeding.
KEYWORDS：
soybean;tolerancetoalkaline-saltstresses;resistancemeasurement;genome-wideassociationstudy;novelallele
符号说明（英文缩略词）
缩写
英文名称
中文名称
CTAB
CetyltrimethylAmmoniumBromide
溴代十六烷基三甲胺
EDTA
EthyleneDiamineTetra-aceticAcid
乙二胺四乙酸
PVP
PolyvinylPyrrolidone
聚乙烯吡咯烷酮
Tris
Tris（Hydroxymethyl）Aminomethane
三（羟甲基）氨基甲烷
DNA
DeoxyriboNucleicAcid
脱氧核糖核酸
Acr
Acrylamide
丙烯酰胺
Bis
Bis-Acrylamide
甲叉双丙烯酰胺
AP
AmmoniumPersulfate
过硫酸铵
TEMED
N，N，N，N-tetramethylethlenediamine
N，N，N，N-四甲基乙二胺
MAS
MolecularMarker-assistedSelection
分子标记辅助选择
PCR
PolymeraseChainReaction
聚合酶链式反应
SSR
SimpleSequenceRepeats
简单序列重复
SNP
SingleNucleotidePolymorphism
单核苷酸多态性
AFLP
AmplifiedFragmentLengthPolymorphism
扩增片断长度多态性
RAPD
RandomAmplifiedPolymorphicDNA
随机扩增多态性DNA
RFLP
RestrictionFragmentLengthPolymorphism
限制性片段长度多态性
EST
ExpressedSequenceTags
表达序列标签
QTL
QuantitativeTraitLocus
数量性状基因座
LD
LinkageDisequilibrium
连锁不平衡
GWAS
Genome-wideAssociationStudy
全基因组关联分析
GLM
GeneralLinearModel
一般线性模型
MLM
MixedLinearModel
混合线性模型
NAM
NestedAssociationMapping
巢式关联作图
cMLM
CompressedMixedLinearModel
压缩的混合线性模型
EAM
EpistaticAssociationMapping
上位性关联分析
ECMLM
EnrichedCompressedMixedLinearModel
改进的压缩混合线性模型
ECMLMA
EnrichedCompressedMixedLinearModel
Advanced
改进的压缩混合线性模型的提高
第一部分文献综述
第一章文献综述
1.盐碱胁迫对大豆生长的影响
盐胁迫对植物生长的影响主要分为两个阶段。
第一阶段，主要通过渗透胁迫抑制植物幼叶的生长，该过程相对较快。
当植株根际的盐溶液浓度达到临界水平时（大豆的临界值大约为40mMNaCl），植株茎和叶的生长量开始下降，新叶、新芽的形成减缓，甚至处于休眠状态，形成的侧枝也相应减少。
在单子叶植物中，盐胁迫的影响主要表现在植株分蘖数下降，从而降低植物总叶面积；而在双子叶植物中则主要是植株的叶片变小，分支数下降。
第二阶段为离子毒害，虽然该过程比较缓慢，但加速了成熟叶片的衰老进程。
当植株成熟叶片中盐浓度达到离子毒害浓度时，老叶衰亡。
因此，当老叶的死亡速率大于新叶的生长速率时，植株光合作用提供的碳水化合物不能满足新叶的要求，导致植株生长率降低。
盐胁迫通过两种不同的作用方式影响植物生长：
第一，土壤中高浓度的盐使得植株根系难以从土壤中吸取水分。
第二，植物体内高浓度的盐对植株产生离子毒害，根系外的盐间接地影响细胞生长，以及相关的代谢（MunnsandTester2008）。
1.1盐胁迫对大豆生长发育的影响
大豆属于中度耐盐碱作物，盐和碱的胁迫效应主要表现在抑制大豆生长（MaasandHoffman1977）。
在大豆中，高浓度的盐胁迫使种子发芽率，植株生物量，作物产量大幅下降；根、茎的生长减缓，茎节数减少，根冠比提高和干物质的积累下降，甚至导致植株衰亡（AbelandArnold1964;Parkeretal.1983;YangandBlanchar1993;Panneerselvametal.1998;罗庆云和於丙军2001;Phangetal.2008;贺莉等2011）。
但也有研究表明：
耐盐性较强的品种（Lee68）在低盐（50mMNaCl）胁迫下，株高反而有所提高（罗庆云和於丙军2001）。
盐胁迫还会降低植株根的渗透调节能力以及钠离子的外排和水分的吸收（Anetal.2001;Joly1989）。
除此之外，盐胁迫对大豆根瘤的形成也有较大影响。
有研究表明：
盐胁迫能显著地降低根瘤数和根瘤干重（BernsteinandOgata1966;SingletonandBohlool1984），致使根际间可利用的有效氧下降，刺激植株无氧呼吸途径（Serrajetal.1994）从而导致根瘤生长受到抑制。
盐胁迫还能显著的增加大豆叶片中氯离子和钠离子含量，而降低钾、钙、镁的累积（Abel1969;Anetal.2001;Essa2002）。
还有研究表明：
盐胁迫下大豆植株体内的可溶性糖，溶性蛋白质，氨基酸，脯氨酸等有机小分子也会发生相应的变化（El-SamadandShaddad1997）。
1.2碱胁迫对大豆生长发育的影响
植株受到碱胁迫的最显著的变化是叶片黄萎和植株矮化。
前人在水稻（Yangetal.1994）、小麦（Millaretal.2007）和番茄（Biatczyketal.1994）等作物中均有研究。
也有研究表明：
碱胁迫通过降低植物对营养物质的吸收，间接地影响植物生长。
高浓度的碳酸氢盐导致向日葵（Alcántaraetal.1988）、花生（ZuoandZhang2008）和玉米（CelikandVahapKatkat2008）出现铁离子缺乏症。
碱对大豆的影响主要体现在三个方面：
第一，高PH值；第二，高浓度的钠离子造成的渗透胁迫和离子毒害；第三，营养缺乏症（Tuyenetal.2010）。
由高PH值引发的大豆营养缺乏已有较多报道（Coulombeetal.1984;Hansenetal.2003;NorvellandAdams2006;Rogovskaetal.2007;Zocchietal.2007）。
2大豆耐盐、碱性鉴定及大豆种质资源耐盐、碱性评价
2.1大豆耐盐碱性鉴定
盐、碱被认为是世界范围内限制大豆生产的主要因子。
因此，鉴定、筛选耐盐碱的优质种质资源直接为生产利用或为育种提供耐盐、碱亲本，对生产或进一步研究大豆耐盐性具有重要意义。
2.1.1耐盐碱的鉴定方法
大豆的耐盐碱性鉴定的方法根据鉴定环境的不同主要分为田间鉴定和室内鉴定。
2.1.1.1田间鉴定
田间鉴定一般在海水倒灌区利用抽提地下咸水与淡水配比成不同浓度的盐溶液处理大豆植株，从而鉴定不同品种的耐盐性。
邵桂花等（1986）在海水倒灌区利用抽提地下水与淡水配比作为处理液，1行区，行长1-1.5m，每行播种50粒，每20行设1行对照，不设重复，在出苗期、苗期和花荚期，分别用电导率10-15ds/m、15-17ds/m和20-24ds/m的处理液进行大豆品种耐盐性鉴定。
马淑时和王伟（1994）在大豆第三片复叶展开时，利用浓度为9.0，电导率为10ds/m的盐碱水进行处理，处理前调查苗数，处理5天后调查症状，试验为双行区，行长2米行距35厘米每行30粒种子，重复3次对照品种为吉林20，以类似于邵桂花等（1986）的相对盐害指数为指标鉴定大豆耐盐性，并把品种耐盐性分为高耐、耐、中耐、敏感和高敏5种类型。
田间鉴定更接近于实际大田生产的环境，但是实验条件难以控制，年份间差异可能较大，需多年多点同时进行鉴定。
2.1.1.2室内鉴定
室内鉴定一般在温室或者在光照培养箱中进行。
罗庆云和於丙军（2001）在玻璃温室中，将事先催芽48小时的大豆选取胚根长度一致的大豆芽转入盛有厚度为10cm石英砂的塑料杯中，每一杯播种8粒，覆盖0.5cm的石英砂，然后将其转入液面高度为5cm的1/2Hoagland营养液的周转箱中，培养至两叶一心后定苗，以含NaCl浓度分别为0、20、100和150mM的1/2Hoagland营养液分别进行培养，14天后，以植株植株衰亡叶面积占总叶面积的百分率为指标鉴定了6个栽培大豆品种的苗期耐盐性。
Valencia等（2008）在温室分别用0、40、80、120和160mM的NaCl培养，鉴定了已知的吸氯品种（Williams、Clark、HBKR4924和Dare）和排氯品种（S-100、Lee68和HBKR5525），并确定浓度为120mM的NaCl溶液是区分吸氯品种和排氯品种最佳浓度。
Lee等（2008）将处于V2和V3（2-3片复叶）时期的大豆苗栽植于盛有沙土的塑料盆中用100mM的NaCl溶液处理以叶面枯萎程度和叶氯含量为指标鉴定了Hutcheson（敏感）、S-100和Forest（耐盐）等14个大豆品种。
那桂秋等（2009）分别用110mM的NaCl和37.5mM的Na2CO3溶液为处理液，分别进行盐、碱胁处理。
对照用蒸馏水代替，在25±1℃的光照培养箱中进行发芽试验。
在处理后的第7天测定发芽率，然后根据种子发芽率计算盐、碱害指数，然后进行耐盐碱性分级。
室内鉴定具有时间短、容量大、重复性强和
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