年产1000吨苏氨酸发酵工艺课程设计.docx

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年产1000吨苏氨酸发酵工艺课程设计

分子量：

119.12

白色斜方晶系或结晶性粉末。

无臭，味微甜。

253℃熔化并分解。

高温下溶于水，25°C溶解度为20.5g/100ml。

等电点5.6。

不溶于乙醇、乙醚和氯仿。

苏氨酸在机体内的代谢途径和其他氨基酸不同，是唯一不经过脱氢酶作用和转氨基作用，而是通过苏氨酸脱水酶（TDH）和苏氨酸脱酶（TDG）以及醛缩酶催化而转变为其他物质的氨基酸。

途径主要有3条：

通过醛缩酶代谢为甘氨酸和乙醛；通过TDG代谢为氨基丙酸、甘氨酸、乙酰COA；通过TDH代谢为丙酸和α-氨基丁酸。

1.1.2苏氨酸的作用来源及发展

苏氨酸是一种重要的营养强化剂，可以强化谷物、糕点、乳制品，和色氨酸一样有缓解人体疲劳，促进生长发育的效果。

医药上，由于苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。

其制剂具有促进人体发育抗脂肪肝药用效能，是复合氨基酸输液中的一个成分。

同时，苏氨酸又是制造一类高效低过敏的抗生素——单酰胺菌素的原料。

苏氨酸用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。

特别是饲料添加剂方面用量增长快速，它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。

随着人民生活水平的提高和养殖业的发展，苏氨酸作为饲料用氨基酸，广泛用于添加仔猪饲料、种猪饲料、肉鸡饲料、对虾饲料和鳗鱼饲料等。

主要食物来源：

发酵食品（谷物制品）、鸡蛋、茼蒿、奶、花生、米、胡萝卜、叶菜类、番木瓜、苜蓿等。

苏氨酸的生产方法主要有发酵法，蛋白质水解法和化学合成法三种，目前微生物发酵法已经成为生产苏氨酸的主流方法。

长期以来，国际市场对苏氨酸的需求持续稳定增长，是需求增长最快的氨基酸品种之一，特别是在化学及生化、食品添加剂、饲料添加剂等方面的用量增长快速，大有取代色氨酸而成为除赖氨酸、蛋氨酸以外的发展最迅速的第三大氨基酸。

目前全世界苏氨酸的需求量不应低于8万t/年，缺口较大，且每年将以10%~12%的速度递增。

苏氨酸发酵法菌种来源有大肠杆菌、短杆菌、谷氨酸棒杆菌等。

2菌种的选择与制备

2.1菌种选择与保藏

2.1.1菌种选择

关于菌种的选择，通过查资料工业一般使用大肠杆菌基因工程，因其产量大，没有反馈抑制，本设计采用大肠杆菌基因工程菌发酵工艺来生产苏氨酸，所以对于菌种来源需要从菌种机构来买。

2.1.2菌种保藏

菌种保藏的原理：

通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以最大限度的降低菌种的代谢强度抑制细菌的生长和繁殖。

由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处于休眠状态，从而可以保藏很长时间。

要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活和繁殖能力，不发生形态特征、生理状态以及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。

此外，保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。

菌种常用的保存的方法有斜面冰箱保藏法、沙土管保藏法、菌丝速冻法、石蜡油封存法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法。

从菌种机构买回来的菌种，为了保证每次接种的菌种稳定，需要对菌种进行扩大并保藏，将菌种接种于LB培养基，稳定培养24h，将所得的菌用甘油冷冻保藏法于-70度保藏。

使用时将菌种表面部分融化，挑取少量于摇瓶培养基中，注意菌种不要全部融化，摇瓶培养所得置于冰箱中供菌种扩大使用。

2.2培养基的设计

2.2.1培养基配置的原则

培养基是指可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，同时也为微生物生长提供除营养外的其他生长所需的条件。

原则上①满足必须的原料；

②生化反应的基本条件（温度、溶氧和pH）；③来源丰富、价格低廉、取材方便、质量稳定；④培养基成分不影响下游产品的提取加工。

2.2.2培养基类型

培养基可以按照用途可以分成，菌种扩大培养基，摇瓶培养基、种子培养基和发酵培养基。

（1）LB培养基

LB培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养

菌种,使菌种成倍扩增,达到使用

（2）摇瓶培养基

孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长迅速,产生数量多而且优质的孢子,并且不会引起菌体变异。

（3）种子培养基

种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮，成为活力强的“种子”。

（4）发酵培养基

发酵培养基既要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的大量合成。

要求培养基的组成应丰富、完全，碳、氮源要注意速效和迟效的互相搭配，少用速效营养，多加迟效营养，还要考虑适当的碳氮比，加缓冲剂稳定pH值；并且还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需的元素、前体和促进剂等。

由于本课题为工业发酵生产，所以选择培养基配料时要注意到经济成本，选用廉价发酵原料根据本地条件，结合实际情况，可选用合适的碳源和氮源。

采用葡萄糖作为主要的碳源，玉米浆作为底料的氮源，玉米浆除能提供必需的氮源外还含有利于产酸的有益生长因子，同时辅以适量的无机盐和其他微量元素。

大肠杆菌的培养基配方及其培养条件

2.2.3培养基配方（百分比）

LB培养基

胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L调节pH到7.4

摇瓶培养基

葡萄搪0.5，牛肉膏1.0，蛋白胨1.0，NaCl0.5，调节pH值在7.0~7.2之间。

种子培养基

葡萄糖3.5，玉米浆1.5，（NH4）2SO40.5，MgSO40.05，KH2PO40.1，CaCO31。

溶解后以NaOH调至pH7.0。

发酵培养基

葡萄糖12~14，玉米浆3.0，（NH4）2SO43.5KH2PO40.1，MgSO40.1，CaCO32，以NaOH调pH至7。

补料培养基

葡萄糖15玉米浆3.0（NH4）2SO42.0以上培养基均在121℃下灭菌20min。

2.2.4培养方法:

摇瓶培养基

在32℃培养18～24h经质量检查合格后，即可利用火焰接种法接种于种子罐。

种子培养基

接种时以1%的接种量接种于2000L种子罐，搅拌转速300～700r/min，通过自动添加氨水控制pH在7.0。

一般培养18~20h，取菌种，分析其pH、残糖、菌体密度及镜检正常后可供发酵罐接种用，利用压差法接种于发酵罐。

发酵培养基

接种时以10%的接种量接种于20000L标准发酵罐中，其装液量为15000L。

罐内培养条件为：

温度32℃，气压l00KPa，通风比前期1∶0.2，中后期1∶0.3，搅拌300r/min，加泡敌作消泡剂。

分批补料发酵周期为60h

补料培养基

在发酵培养基培养12h后，当总糖浓度低于5.5%时，开始补料，补料计量根据发酵液情况而定。

2.3培养基的营养要求

碳源

主要以淀粉水解糖作为碳源，生产过程中应注意控制其浓度，当碳源浓度

过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。

氮源

包括铵盐、尿素、氨水等，同时有调节pH值的作用。

对于营养缺陷型菌

株应以添加有机氮源水解液为主。

需生物素和氨基酸时，应以玉米浆作氮源。

尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。

可分批流加。

氨水用pH自动控制连续流加。

此外，还应注意合适的C/N比。

磷酸盐

对发酵有显著影响，不足时糖代谢受抑制，要根据菌种不同的培养及生产阶段及时的调整用量。

镁

镁是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。

可通过添加MgSO4防止发酵过程中的缺乏。

钾

钾可以促进糖的代谢，钾的量较多时利于产酸，钾的量较少时利于菌体生长。

可以根据不同的目的和需要调整钾的用量。

其他微量元素钠可调节细胞内外的渗透压，一般在调节pH值时加入。

锰是许多酶的激活剂。

而铜离子则对氨基酸发酵有明显毒害作用

生长因子

生长因子是指氨基酸、核苷酸、维生素、脂肪酸等菌体必须地生理活性物

质。

水

水是生命活动不可或缺的物质，是细胞的主要成分，良好的介质，营养传递的道体，调节细胞生长。

2.4发酵条件的研究

细菌生长曲线可划分为四个时期，即：

①延迟期，②对数生长期，③稳定期，④衰亡期。

生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中，生长繁殖直至衰老死亡的动力学变化过程。

生长曲线各个时期的特点，反映了所培养的细菌细胞与其所处环境间进行物质与能量交流，以及细胞与环境间相互作用与制约的动态变化。

深入研究各种单细胞微生物生长曲线各个时期的特点与内在机制，在微生物学理论与应用实践中都有着十分重大的意义。

处于对数生长期的细胞，由于代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，个体形态、

化学组成和生理特性等均较一致，因此，在微生物发酵生产中，常用对数期的菌体作种子，它可以缩短延迟期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。

对数生长期的细胞也是研究微生物生长代谢与遗传调控等生物学基本特性的极好材料。

因此如果确定了菌体的生长曲线，那么就可以选择合适的时间接种，从而达到虽好的发酵效果。

在发酵的过程中，苏氨酸产量会随时间呈曲线变化，在某一段时期内菌体产苏氨酸的量会达到最大值，这个时间段就是最佳的发酵时间。

2.5灭菌

所谓灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。

2.5.1灭菌方法

灭菌，就是指用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。

常用的灭菌方法有以下几种：

（1）化学药剂能使微生物中的蛋白质、酶及核酸发生反应而具有杀菌作用，如甲醛、氯、高锰酸钾、环氧乙烷等。

（2）紫外线灭菌：

波长为（2.1～3.1）×10-7m的紫外线有灭菌作用，最常用的波长为2.537×10-7m的紫外线，但紫外线的穿透力低不适用于培养基灭菌。

（3）干热灭菌的条件为在160℃下保温1小时。

适用于一些要求干燥的实验器具和材料的灭菌。

（4）湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌。

通常的蒸汽灭菌条件为在121℃

（表压约0.1MPa）维持30分钟。

2.5.2培养基的湿热灭菌

本实验采用湿热灭菌，条件为在121℃（表压约0.11MPa）维持30分钟。

对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡速率与残存数量成

正比，即

式中：

培养基中活微生物的个数；τ为微生物受热时间，s；κ为比死亡速率；

上式被称为对数残留定律。

其中N为经τ时间灭菌后培养基中活微生物数。

连续灭菌将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程。

分批灭菌就是将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。

分批灭菌是中小型发酵罐常用的一种灭菌方法。

分批灭菌的优点是不需要专门的灭菌设备，投资少，设备简单，灭菌效果可靠。

分批灭菌的缺点是发酵罐占用时间长，培养基的营养成分破坏程度较大。

连续灭菌流程图如图2-1所示。

图2-1连续灭菌的流程图

由于本设计使用的发酵罐较小所以本生产利用分批灭菌即实罐灭菌的方法。

2.5.3分批灭菌

分批灭菌是指将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度，也叫间歇灭菌、实罐灭菌。

实罐灭菌无需专门的灭菌设备，灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽要求低（0.1-0.3MPa