天然药物分析方法.docx

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天然药物分析方法

天然药物分析方法

二、水蒸汽蒸馏法：

挥发油、小分子化合物三、升华法：

樟脑、香豆素四、压榨法：

龙舌兰中海柯皂苷元五、酶解法：

苷元六、化学法：

内酯七、超声波萃取八、超临界流体萃取（SFE）九、膜分离技术大类成分样品制备一、生物碱强碱非极性有机溶剂萃取极性有机溶剂萃取水提或酸水提弱碱有机溶剂直接提取水溶性生物碱或季铵碱：

雷氏盐、磷钨酸挥发性生物碱：

水蒸气蒸馏、升华法二、黄酮醇提铅盐沉淀法三、皂苷：

醇提精制方法醇－醚沉淀法铅盐沉淀法胆甾醇沉淀法氧化镁吸附法四、强心苷：

醇提五、挥发油水蒸汽蒸馏浸取法：

石油醚吸收法：

豚脂、牛脂冷压法第三节供试品溶液的精制溶剂分离法：

多糖提取、去蛋白液液萃取：

石油醚除脂溶性色素沉淀法：

醋酸铅除酸性物质和鞣质盐析法：

丹皮酚－－氯化钠色谱法：

柱色谱、薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等常见杂质的处理1、鞣质：

明胶沉淀、生物碱沉淀、醋酸铅、氨水沉淀2、叶绿素：

苯、氯仿、铅盐3、油脂、蜡和树脂：

石油醚、苯4、蛋白质：

乙醇、甲醇、铅盐5、无机盐：

醇提、透析6、糖和淀粉：

有机溶剂提取水分检查法烘干法（不含或少含挥发性成分）甲苯法（含挥发性成分）减压干燥法（含挥发性成分贵重药）GC法（气相色谱法）古蔡法检查砷的原理为金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷盐反应生成具挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸，产生黄色至棕色的砷斑，与一定量标准砷溶液所生成的砷班比较，判定药物中砷盐的含量。

醋酸铅棉花、溴化汞试纸、标准砷溶液、盐酸、碘化钾试液、酸性氯化亚锡试液、锌粒常用的理化鉴定方法显微鉴别定性反应（颜色或沉淀反应）色谱法波谱法

（2）颜色或沉淀反应各类成分因结构或功能团的不同，常与某些特定试剂发生反应，产生不同的颜色或沉淀。

生物碱与碘化铋钾生成橙色沉淀；蒽醌类与碱液反应生成橙、红、蓝色；黄酮类与盐酸镁粉的反应内酯类的异羟肟酸铁反应皂甙类的Liebermann一Burchard反应酚类的三氯化铁反应鞣质的明胶沉淀反应氨基酸的茚三酮反应糖类的苯酚－硫酸反应等。

对照药材法阳性对照：

将要鉴别的药材按制剂工艺处理，再按鉴别方法提取的溶液阴性对照：

把制剂中要鉴别的药材除去，用剩下的各味药按制剂工艺处理，再按鉴别方法提取的溶液分析实例万氏牛黄清心丸牛黄清热解毒药，主含胆酸类成分。

黄连清热燥湿药，主要为小檗碱。

黄芩清热燥湿药，主要为黄酮类。

栀子清热泻火药，主含栀子甙。

朱砂安神药，主含硫化汞（HgS）。

郁金活血去瘀药，主含挥发油。

化学鉴别1.朱砂的鉴别取本品3g，加水适量，研匀，反复洗去悬浮物，可得少量朱红色沉淀，取出，加入盐酸1ml及铜片少量，加热煮沸，铜片由黄色变为银白色。

HgS+2HCl+CuCuCl2+Hg+H2S在酸性条件下，朱砂与铜片发生置换反应析出金属汞，在铜片表面形成银白色汞齐色谱鉴别2.人工牛黄的鉴别取本品，剪碎，加硅藻土0.6g，研匀，加氯仿10ml、冰醋酸0.5ml，加热回流30min,放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。

胆酸和猪去氧胆酸加乙醇制成1ml含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。

TLC法CMC-Na，硅胶G展开剂醋酸乙酯-正己烷-醋酸-甲醇（32:

6:

1:

1）显色剂10%磷钼酸乙醇液，1100C,10min黄芩的鉴别供试品溶液的制备：

取本品3g，剪碎，加硅藻土0.5g，研匀，加甲醇20ml，加热回流1hr,放冷，滤过，滤液作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：

黄芩苷对照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

TLC法CMC-Na，硅胶G（4%醋酸钠）使斑点更为集中展开剂醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5:

3:

1:

1）显色剂2%三氯化铁乙醇液-OH与Fe+3络合5.黄连的鉴别供试品溶液的制备：

取含量测定项下剩余的盐酸-甲醇提取液4ml，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，使成1ml作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：

黄连对照药材50mg，加甲醇10ml，回流加热15min,滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。

对照品溶液的制备：

再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液TLC法硅胶GCMC-Na展开剂苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液（12:

6:

3:

3:

1）显色方式UV（365nm硅胶：

微酸性极性固定相，适用于酸性、中性物质分离（可以制备成酸度不同或碱性硅胶扩大使用范围）氧化铝：

碱性极性固定相，适用于碱性、中性物质分离（可以制备成中性或酸性氧化铝扩大使用范围）聚酰胺：

含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、醇类化合物的分离纤维素：

含有羟基的极性固定相，适用于分离亲水性物质.薄层扫描仪中国药典采用双波长薄层扫描仪实例2用气相色谱法同时测定石菖蒲挥发油中-细辛醚和-细辛醚的含量色谱条件HP-35（二苯基-65%-二甲基硅氧烷共聚物）毛细管气相色谱柱;程序升温:

起始温度为30℃,升至220℃,保持5m进样口温度:

250℃;检测器温度:

320℃;进样量:

2.0l;无分流进样;溶剂:

甲醇;载气:

氦气;柱头压:

5.504Pa;内标物:

-萘酚。

样品溶液的制备用水蒸汽蒸馏法提取石菖蒲中的挥发油,称取适量,以-萘酚,以甲醇溶解,进样。

对照品溶液的制备称取-细辛醚、-细辛醚对照品适量,加0.2mgml1-萘酚的甲醇溶液制成含-细辛醚的对照品溶液

（1）和含-细辛醚的对照品溶液（。

灵敏度分析方法的灵敏度是指单位浓度（或量）与响应值的比值。

检测限：

以信噪比来确定检测限的最低水平。

回收率．加样回收率即于已知被测成分含量的成药中再精密加入一定量的被测成分纯品2．以成药空白所做的加样回收率在成药空白（9即除去欲测成分的药材后制成的成药））中加入一定量的被测纯品，依法测定。

示例治伤软膏中苦参碱的含量测定色谱条件的选择2.1固定相的选择曾采用苯基柱、C8、ODS、硅胶柱、DIOL和氰基柱，苦参碱、槐定碱和槐果碱均不能达到良好的分离；考虑到用反相色谱柱时，软膏基质影响色谱柱寿命最终参考苦参国家标准中苦参碱、氧化苦参碱的含量测定方法，选用氨基键合硅胶为固定相，本试验采用L）色谱柱。

2.2流动相的选择采用氨基柱，试验了如下几种流动相系统，见表1。

最终采用苦参国家标准中苦参碱、氧化苦参碱含量测定用流动相：

乙腈-无水乙醇-3%磷酸，结合本药实际情况，将比例调整为表1流动相系统的选择乙腈-无水乙醇-3%磷酸（84:

9:

7）苦参碱出峰时间合适，无干扰，苦参碱出峰太慢乙腈-无水乙醇-0.1%磷酸（调节PH至2.5），（80:

10:

10）乙腈-无水乙醇-3%磷酸（80:

10:

10）苦参碱出峰太早，有干扰结果流动相组成2.3检测波长的选择采用苦参国家标准中苦参碱、氧化苦参碱的含量测定用波长220nm前处理方法的选择先后采用甲醇水浴提取法，乙醇水浴提取法，氯仿放置过夜提取法，氯仿振摇提取法，氯仿回流法，氯仿超声提取法。

甲醇、乙醇水浴提取方法简单，但提取出的成分复杂，干扰苦参碱的测定。

以氯仿作为提取溶剂提取率高且杂质干扰少，我们比较了以下几种提取方法：

氯仿放置过夜提取法、氯仿振摇提取法、氯仿回流法、氯仿超声提取法。

氯仿放置过夜提取和氯仿振摇提取法提取率均不高且操作不便，费时。

通过比较，超声提取和回流提取测得的含量接近，因超声提取操作步骤简单，所以选择此方法处理供试品。

3.1超声时间的考察表2超声时间的考察0.0560.0600.0600.0650.065苦参碱含量（%）超声时间（min）3.2冰浴时间的考察为了防止软膏中脂溶性基质影响色谱柱寿命，采取冰浴的方式使脂溶性基质尽可能析出，再离心除去。

表3冰浴时间的考察测得含量（％）冰浴时间（min）2040506070试验结果表明：

冰浴1小时以内不会造成样品含量降低考虑时间长有利于基质析出，最终确定为60min。

复溶溶剂的选择曾选用甲醇作测定法色谱条件及系统适用性以氨基键合硅胶为填充剂；以乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液（84:

9:

7）为流动相；检测波长220nm。

理论板数按苦参碱峰计算应不低于1500。

对照品溶液的制备精密称取苦参碱对照品适量，加流动相溶解，制成每1ml含苦参碱80g的溶液，即得。

供试品溶液的制备取本品内容物约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，尽可能平铺于底部，加氨水1ml，充分浸润膏体后，精密加入氯仿50ml，密塞，称定重量，60℃超声处理（功率250W，频率40kHz）1小时，放冷，再称定重量，用氯仿补足减失的重量，摇匀，转移至分液漏斗中，分取氯仿层，滤过，精密量取续滤液25ml置100ml烧杯中，80℃水浴蒸干，残渣精密加入流动相10ml，密闭，超声3分钟，并时时振摇，所得溶液转移至10ml具塞玻璃离心管中，密塞，置冰浴中静置1小时，离心20分钟（4000转/分），取上清液作为供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20l，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每支含苦参碱（C15H24N2O）不得少于10mg。

为复溶溶剂，图谱显示对苦参碱峰有干扰，采用流动相复溶没有干扰，所以选择流动相为溶剂。

5方法学验证5.1专属性试验①空白溶剂的制备流动相作为空白溶剂：

乙腈-无水乙醇-3%磷酸（84:

9:

7）；②苦参碱对照品溶液的制备取苦参碱对照品约10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取20ml置50ml容量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，精密量取20l，注入液相色谱仪，测定，即得；③苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱混合对照溶液的制备分别取上述对照品适量，流动相溶解，摇匀，即得；④不含苦参的阴性对照供试品溶液的制备取不含苦参的阴性对照软膏内容物约2.5g，依测定法中供试品溶液的制备方法操作，即得；⑤软膏供试品溶液的制备定量限苦参碱对照溶液稀释浓度为每1ml含245ng的溶液时，色谱图中苦参碱的信噪比约为10（见附图6），所以苦参碱的最低定量限为245ng/ml线性试验精密称取苦参碱对照品12.25mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释制成每1ml含245g的溶液，作为贮备液；分别精密量取贮备液2、5、10、12.5和20ml于25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，得稀释液

（1）、

（2）、（3）、（4）和（5）。

分别精密量取各稀释液20l，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定结果见表。

Y=9943.8X-8472.9回归方程187387481722961907120682919415452428906平均峰面积（A）C（g/ml）19.64998122.51962455.4精密度试验重复性取2批供试品，照测定法项下方法操作，一天内共分析6次，计算含量201971101批治伤软膏重复性试验考察RSD%1.80平均值（mg支）含量（mg/18.支）分析次数12中间精密度进样精密度试验6回收率试验取苦参碱对照品约21mg，精密称定，置50ml量瓶中，用纯水溶解并稀释到刻度，制成422.9g/ml的对照品储备液。

取20071101批供试品的内容物约1.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，制备9份；分别精密加入苦参碱对照品储备液各1、2、3ml，制成75％、100％和125％三个浓度水平的供试品（每个浓度水平3份），按测定法项下测定，由重复性试验知道本批供试品苦参碱含量为0.06％，按下式计算回收率：

回收率％＝（测得总量－内容物含苦参碱量）／/对照品加入量（mg）100％回收率试验表明，三个浓度水平测定的回收率均在95.0%-105.0%之间溶液稳定性试验耐用性试验三批供试品的含量测定：

每支软膏中含苦参碱约为18mg。

规定本品每支软膏含苦参碱（C15H24N2O）不得少于黄杨宁片中黄杨宁的含量测定本品为黄杨宁经加工制成的片剂。

每片含环维黄杨星D0.5mg或1mg。

对照品溶液的制备精密称取经105℃干燥至恒重的环维黄杨星D对照品25mg，置250ml量瓶中，加甲醇70ml使溶解,用0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，用0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml含环维黄杨星D10g）。

环维黄杨星D10mg。

供试品溶液的制备取本品20片（每片含环维黄杨星D0.5mg），精密称定（2.050g），研细，精密称取0.1020g（约相当于黄杨0.5mg），置50ml量瓶中，加0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至近刻度，80℃水浴恒温1.5小时后取出，冷却至室温,加0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至刻度，摇匀，离心6分钟（每分钟转速3000转），取上清液，即得。

测定法精密量取对照品溶液与供试品溶液各5ml,分别置分液漏斗中，各精密加入溴麝香草酚蓝溶液（取溴麝香草酚蓝18mg，置250ml量瓶中，加甲醇5ml使溶解，加0.05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至刻度，摇匀，即得）5ml，摇匀，立即分别精密加入氯仿10ml，振摇2分钟，静置1.5小时，分取氯仿层，置含0.5g无水硫酸钠的具塞试管中，振摇，静置，取上清液，照分光光度法（附录ⅤA），在410nm的波长处分别测定吸收度（A对＝0.454A供＝0.445），计算，即得。

本品每片含黄杨宁以环维黄杨星D（C26H46N2O）计，应为标示量90.0%～110.0％。

【注】环维黄杨星D无紫外吸收，故本法采用酸性染料比色法＋+In＋In－溴麝香草酚蓝阴离子＋生物碱盐阳离子＋InBH－（反应条件缓冲液（pH6.8））－定量生成BHInBHBH－有色络合物（溶于氯仿max410nm）－＋

（1）求算供试液的浓度C供（g/ml）=（A供/A对）C对=9.8

（2）求算供试品的含量（标示量％）=96.5％C供（mg/ml）10-350ml平均片重（mg）取样量（mg）标示量（mg）含量==96.5％