天然药物分析方法.docx

1、天然药物分析方法 天然药物分析方法 二、 水蒸汽蒸馏法： 挥发油、 小分子化合物 三、 升华法： 樟脑、 香豆素 四、 压榨法： 龙舌兰中海柯皂苷元 五、 酶解法： 苷元 六、 化学法： 内酯 七、 超声波萃取 八、 超临界流体萃取（SFE) 九、 膜分离技术 大类成分样品制备 一、 生物碱 强碱 非极性有机溶剂萃取 极性有机溶剂萃取 水提或酸水提 弱碱有机溶剂直接提取 水溶性生物碱或季铵碱： 雷氏盐、 磷钨酸 挥发性生物碱： 水蒸气蒸馏、 升华法 二、 黄酮 醇提 铅盐沉淀法 三、 皂苷： 醇提 精制方法 醇醚沉淀法 铅盐沉淀法 胆甾醇沉淀法 氧化镁吸附法 四、 强心苷： 醇提 五、 挥发油

2、 水蒸汽蒸馏 浸取法： 石油醚 吸收法： 豚脂、 牛脂 冷压法 第三节供试品溶液的精制 溶剂分离法： 多糖提取、 去蛋白 液液萃取： 石油醚除脂溶性色素 沉淀法： 醋酸铅除酸性物质和鞣质 盐析法： 丹皮酚氯化钠 色谱法： 柱色谱、 薄层色谱、 气相色 谱、 高效液相色谱等 常见杂质的处理 1、 鞣质： 明胶沉淀、 生物碱沉淀、 醋酸 铅、 氨水沉淀 2、 叶绿素： 苯、 氯仿、 铅盐 3、 油脂、 蜡和树脂： 石油醚、 苯 4、 蛋白质： 乙醇、 甲醇、 铅盐 5、 无机盐： 醇提、 透析 6、 糖和淀粉： 有机溶剂提取 水分检查法 烘干法（不含或少含挥发性成分） 甲苯法（含挥发性成分） 减压

3、干燥法（含挥发性成分贵重药） GC法（气相色谱法） 古蔡法 检查砷的原理为金属锌与酸作用产生新 生态的氢， 与药物中微量砷盐反应生成具挥发 性的砷化氢， 遇溴化汞试纸， 产生黄色至棕色 的砷斑， 与一定量标准砷溶液所生成的砷班比 较， 判定药物中砷盐的含量。 醋酸铅棉花、 溴化汞试纸、 标准砷溶液、 盐 酸、 碘化钾试液、 酸性氯化亚锡试液、 锌粒 常用的理化鉴定方法 显微鉴别 定性反应（颜色或沉淀反应） 色谱法 波谱法 （2） 颜色或沉淀反应 各类成分因结构或功能团的不同， 常与某些 特定试剂发生反应， 产生不同的颜色或沉 淀。 生物碱与碘化铋钾生成橙色沉淀； 蒽醌类与碱液反应生成橙、 红、

4、 蓝色； 黄酮类与盐酸镁粉的反应 内酯类的异羟肟酸铁反应 皂甙类的Liebermann一Burchard反应 酚类的三氯化铁反应 鞣质的明胶沉淀反应 氨基酸的茚三酮反应 糖类的苯酚硫酸反应等。 对照药材法 阳性对照： 将要鉴别的药材按制剂工艺处理， 再按鉴别方法提取的溶液 阴性对照： 把制剂中要鉴别的药材除去， 用剩 下的各味药按制剂工艺处理， 再按鉴别方法提 取的溶液分析实例万氏牛黄清心丸 牛黄清热解毒药， 主含胆酸类成分。 黄连清热燥湿药， 主要为小檗碱。 黄芩清热燥湿药， 主要为黄酮类。 栀子清热泻火药， 主含栀子甙。 朱砂安神药， 主含硫化汞（HgS） 。 郁金活血去瘀药， 主含挥发油

5、。 化学鉴别1. 朱砂的鉴别 取本品3g， 加水适量， 研匀， 反复 洗去悬浮物， 可得少量朱红色沉淀， 取 出， 加入盐酸1ml及铜片少量， 加热煮 沸， 铜片由黄色变为银白色。 HgS + 2HCl + Cu CuCl2+ Hg + H2S 在酸性条件下， 朱砂与铜片发生置换 反应析出金属汞， 在铜片表面形成银白色 汞齐 色谱鉴别2. 人工牛黄的鉴别 取本品， 剪碎， 加硅藻土0. 6g， 研匀， 加氯仿10ml、 冰醋酸0. 5ml， 加热回流30min, 放冷， 滤过， 滤液蒸 干， 残渣加乙醇2ml使溶解， 滤过， 滤液作为供试品溶液。 胆酸和猪去氧胆酸加乙醇制成 1ml含1mg的混

6、合溶液， 作为对照品溶 液。 TLC法CMC-Na， 硅胶G 展开剂 醋酸乙酯-正己烷-醋酸-甲醇 （32: 6: 1: 1） 显色剂 10%磷钼酸乙醇液， 1100C, 10min 黄芩的鉴别 供试品溶液的制备： 取本品 3g， 剪碎， 加硅藻土0. 5g， 研匀， 加甲醇20ml， 加热回流1hr, 放冷， 滤过， 滤液作为供试品溶液。 对照品溶液的制备： 黄芩苷对 照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶 液， 作为对照品溶液。 TLC法CMC-Na， 硅胶G （4%醋酸钠） 使斑点更为集中 展开剂醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水 （5:3:1:1） 显色剂2%三氯化铁乙醇液-OH与Fe+3络合 5.

7、 黄连的鉴别 供试品溶液的制备： 取含量测定项下剩余的 盐酸-甲醇提取液4ml， 水浴蒸干， 残渣加 甲醇溶解， 使成1ml作为供试品溶液。 对照药材溶液的制备： 黄连对照药材50mg， 加甲醇10ml， 回流加热15min , 滤过， 滤液 蒸干， 残渣加甲醇1ml使溶解， 作为对照药 材溶液。 对照品溶液的制备： 再取盐酸小檗碱对照 品， 加甲醇制成每1ml含0. 5mg的溶液， 作 为对照品溶液TLC法 硅胶G CMC-Na 展开剂 苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓 氨试液（12: 6: 3: 3: 1） 显色方式 UV（365nm 硅胶： 微酸性极性固定相， 适用于 酸性、 中性物质分离

8、（可以制备成酸度不 同或碱性硅胶扩大使用范围） 氧化铝： 碱性极性固定相， 适用于 碱性、 中性物质分离（可以制备成中性或 酸性氧化铝扩大使用范围） 聚酰胺： 含有酰胺基极性固定相， 适用于酚类、 醇类化合物的分离 纤维素： 含有羟基的极性固定相， 适用于分离亲水性物质 .薄层扫描仪中国药典采用双波长薄层扫描仪实例 2 用气相色谱法同时测定石菖蒲挥发油中 -细辛醚和 -细辛醚的含量 色谱条件 HP-35 (二苯基-65%-二甲基硅氧烷共聚物)毛细管 气相色谱柱; 程序升温:起始温度为30 ,升至220 , 保持5m进样口温度:250 ; 检测器温度:320 ; 进样量:2. 0 l ;无分流进

9、样; 溶剂:甲醇; 载气:氦气; 柱头压:5. 5 04Pa ;内标物: -萘酚。 样品溶液的制备 用水蒸汽蒸馏法提取石菖蒲中的挥发油,称取适量,以 -萘酚,以甲醇溶解,进样。 对照品溶液的制备称取 -细辛醚、 -细辛醚对照品适量,加0.2mgml 1 -萘酚的甲醇溶液制成含 -细辛醚的对照品溶液(1) 和含 -细辛醚的对照品溶液( 。 灵敏度 分析方法的灵敏度是指单位浓度(或量) 与响应值的比值。 检测限： 以信噪比来确定检测限的 最低水平。 回收率 加样回收率 即于已知被测成分含量的成药中再精 密加入一定量的被测成分纯品 2 以成药空白所做的加样回收率 在成药空白（9即除去欲测成分的药材后

10、 制成的成药)） 中加入一定量的被测纯品， 依 法测定。 示例治伤软膏中苦参碱的含量测定色谱条件的选择 2.1固定相的选择 曾采用苯基柱、 C8、 ODS、 硅胶柱、 DIOL和氰基柱， 苦参碱、 槐定碱和槐果碱均不能达到良好的分离； 考虑到用反相色谱柱时， 软膏基质影响色谱柱寿命 最终参考苦参国家标准中苦参碱、 氧化苦参碱的含量测 定方法， 选用氨基键合硅胶为固定相， 本试验采用 L)色谱柱。 2.2 流动相的选择 采用氨基柱， 试验了如下几种流动相系统， 见表1。 最终采用 苦参国家标准中苦参碱、 氧化苦参碱含量测定用流动相： 乙 腈-无水乙醇-3%磷酸， 结合本药实际情况， 将比例调整为

11、 表1 流动相系统的选择 乙腈-无水乙醇-3%磷酸(84:9:7) 苦参碱出峰时间合适， 无干扰， 苦参碱出峰太慢 乙腈-无水乙醇-0.1%磷酸(调节 PH至2.5)， (80:10:10) 乙腈-无水乙醇-3%磷酸(80:10:10) 苦参碱出峰太早， 有干扰 结果 流动相组成2.3检测波长的选择 采用苦参国家标准中苦参碱、 氧化苦参 碱的含量测定用波长220 nm前处理方法的选择 先后采用甲醇水浴提取法， 乙醇水浴提取法， 氯仿放置过夜 提取法， 氯仿振摇提取法， 氯仿回流法， 氯仿超声提取法。 甲醇、 乙醇水浴提取方法简单， 但提取出的成分复杂，干扰 苦参碱的测定。 以氯仿作为提取溶剂提

12、取率高且杂质干扰少， 我们比较了以 下几种提取方法： 氯仿放置过夜提取法、 氯仿振摇提取法、 氯仿回流法、 氯仿超声提取法。 氯仿放置过夜提取和氯仿振 摇提取法提取率均不高且操作不便， 费时。 通过比较， 超声 提取和回流提取测得的含量接近， 因超声提取操作步骤简 单， 所以选择此方法处理供试品。 3.1 超声时间的考察 表2 超声时间的考察 0.056 0.060 0.060 0.065 0.065 苦参碱含量(%) 超声时间(min) 3.2冰浴时间的考察 为了防止软膏中脂溶性基质影响色谱柱寿 命， 采取冰浴的方式使脂溶性基质尽可能析 出， 再离心除去。 表3冰浴时间的考察 测得含量（）

13、冰浴时间（min） 20 40 50 60 70 试验结果表明： 冰浴1小时以内不会造成样品含量降低 考虑时间长有利于基质析出， 最终确定为60 min。 复溶溶剂的选择 曾选用甲醇作测定法 色谱条件及系统适用性以氨基键合硅胶为填充剂； 以乙腈-无水乙醇-3% 磷酸溶液(84:9:7)为流动相； 检测波长220 nm。 理论板数按苦参碱峰计算 应不低于1500。 对照品溶液的制备精密称取苦参碱对照品适量， 加流动相溶解， 制成每 1ml含苦参碱80 g的溶液， 即得。 供试品溶液的制备取本品内容物约2.5 g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 尽可能平铺于底部， 加氨水1 ml， 充分浸润膏体后

14、， 精密加入氯仿50 ml， 密塞， 称定重量， 60 超声处理（功率250W， 频率40kHz） 1小 时， 放冷， 再称定重量， 用氯仿补足减失的重量， 摇匀， 转移至分液漏斗 中， 分取氯仿层， 滤过， 精密量取续滤液25 ml置100 ml烧杯中， 80水 浴蒸干， 残渣精密加入流动相10 ml， 密闭， 超声3分钟， 并时时振摇， 所 得溶液转移至10ml具塞玻璃离心管中， 密塞， 置冰浴中静置1小时， 离心 20分钟（4000转/分） ， 取上清液作为供试品溶液。 测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 l， 注入液相色谱 仪， 测定， 即得。 本品每支含苦参碱（C15H2

15、4N2O） 不得少于10 mg。 为复溶溶剂， 图谱显示对苦参 碱峰有干扰， 采用流动相复溶没有干扰， 所 以选择流动相为溶剂。 5 方法学验证 5.1专属性试验 空白溶剂的制备 流动相作为空白溶剂： 乙腈-无水乙醇-3%磷 酸（84:9:7）； 苦参碱对照品溶液的制备 取苦参碱对照品约10 mg， 精密称定， 置50 ml容量瓶中，流动相溶解并 稀释至刻度， 摇匀， 精密量取20 ml置50 ml容量瓶中， 流动相稀释至刻 度， 摇匀， 作为对照品溶液， 精密量取20 l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得； 苦参碱、 氧化苦参碱、 槐定碱、 槐果碱、 氧化槐果碱混合对照溶液的 制备 分别取上

16、述对照品适量， 流动相溶解， 摇匀， 即得； 不含苦参的阴性对照供试品溶液的制备 取不含苦参的阴性对照软膏内容物约2.5 g， 依测定法中供试品溶液的 制备方法操作， 即得； 软膏供试品溶液的制备定量限 苦参碱对照溶液稀释浓度为每1 ml含245 ng的溶 液时， 色谱图中苦参碱的信噪比约为10（见附图 6） ， 所以苦参碱的最低定量限为245 ng/ml线性试验 精密称取苦参碱对照品12.25 mg， 置50 ml量瓶中， 加流动相溶 解并稀释制成每1 ml含245 g的 溶液， 作为贮备液； 分别精密量取贮备液2、 5、 10、 12.5和20 ml于25 ml量瓶中， 用 流动相稀释至刻

17、度， 摇匀， 得稀释 液(1)、 (2)、 (3)、 (4)和(5)。 分别精密量取各稀释液20 l， 注 入液相色谱仪， 记录色谱图， 测定 结果见表。 Y=9943.8X-8472.9 回归方程 187387 481722 961907 1206829 1941545 2428906 平均峰面积 （A） C（ g/ml） 19.6 49 98 122.5 196 2455.4 精密度试验 重复性 取2批供试品， 照测定法项下方法操 作， 一天内共分析6次， 计算含量 201971101批治伤软膏重复性试验考察 RSD% 1.80 平均值（mg支） 含量（mg/ 18.支） 分析次数1 2

18、中间精密度 进样精密度试验 6回收率试验 取苦参碱对照品约21 mg， 精密称定， 置50 ml量瓶中，用纯水溶解并稀释到刻度， 制成422.9 g/ml的对照品储备液。 取20071101批供试品的内容物约1.25 g， 精密称定， 置具 塞锥形瓶中， 制备9份； 分别精密加入苦参碱对照品储备 液各1、 2、 3 ml， 制成75、 100和125三个浓度水平的供试品（每个浓度水平3份） ， 按测定法项下测定， 由重复性试验知道本批供试品苦参碱含量为0.06， 按下式计算回收率： 回收率（测得总量内容物含苦参碱量） /对照品加入量（mg） 100回收率试验表明， 三个浓度水平测定的回收率均在

19、95.0%-105.0%之间溶液稳定性试验耐用性试验三批供试品的含量测定： 每支软膏中含苦参碱约为18mg。 规定本品每支软膏含苦参碱（C15H24N2O） 不得少于黄杨宁片中黄杨宁的含量测定 本品为黄杨宁经加工制成的片剂。 每片含环维黄杨星D 0. 5mg或1 mg。 对照品溶液的制备精密称取经1 05干燥至恒重的环维黄杨星D对照品 25mg， 置250ml 量瓶中， 加甲醇70ml 使溶解, 用 0. 05mol /L磷酸二氢钠缓冲液稀释至刻度， 摇 匀， 精密量取1 0ml ， 置1 00ml 量瓶中， 用 0. 05mol /L磷酸二氢钠缓冲液稀释至刻度， 摇 匀， 即得（每1 ml

20、含环维黄杨星D1 0 g） 。 环维黄杨星D1 0mg。 供试品溶液的制备取本品20片（每片含环维黄杨星D0.5m g ） ， 精密称定（2. 050g） ， 研细， 精密称取0. 1 020g（约相当于黄杨0.5m g） ， 置50ml 量瓶中， 加0. 05mol /L磷酸二氢钠缓冲液至近刻度， 80水浴恒温 1 . 5小时后取出， 冷却至室温, 加0. 05mol /L磷酸二氢钠缓冲液至刻度， 摇 匀， 离心6分钟（每分钟转速3000转） ， 取上清液，即得。 测定法精密量取对照品溶液与供试品溶液各5ml ,分别置分液漏斗 中， 各精密加入溴麝香草酚蓝溶液（取溴麝香草酚蓝1 8mg， 置

21、250ml 量瓶 中， 加甲醇5ml 使溶解， 加0. 05mol/L磷酸二氢钠缓冲液至刻度， 摇匀， 即 得） 5ml ， 摇匀， 立即分别精密加入氯仿1 0ml ， 振摇2分钟， 静置1 . 5小时， 分取氯仿层， 置含0. 5g无水硫酸钠的具塞试管中，振摇， 静置， 取上清 液， 照分光光度法（附录 A） ， 在41 0nm的波长处分别测定吸收度 （ A对 0. 454 A供0. 445） ， 计算， 即得。 本品每片含黄杨宁以环维黄杨星D(C2 6 H4 6 N2 O)计， 应为标示量 90.0% 1 1 0. 0。 【注】 环维黄杨星D无紫外吸收， 故本法采用酸性染料比色法 + InIn溴麝香草酚蓝阴离子 生物碱盐阳离子 InBH（反应条件缓冲液（pH6. 8） ） 定量生成BHInBHBH有色络合物（溶于氯仿 max 410nm ） （1 ） 求算供试液的浓度 C供（ g/m l） = （A供/A对） C对= 9.8 （2） 求算供试品的含量（标示量） = 96.5 C供（mg/ml） 10-3 50ml 平均片重（mg） 取样量（mg） 标示量（mg） 含量= = 96.5