整理蛋白表达纯化实验步骤.docx

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整理蛋白表达纯化实验步骤

【2017年整理】蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进）

1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、设计蛋白表达引物。

引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因cDNA.

4、双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。

表达菌株如Bl21（DE3）、Rosettagami（DE3）、

Bl21codon（DE3）等。

7、蛋白的诱导表达。

1）将表达菌株在3mlLB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM

到1mM。

37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）。

2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

注:

目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体

蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3）将有表达的菌株10%甘油保种，保存1ml左右就足够了，并记录IPTG浓度范围。

甘油是用0.22μm过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。

4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌，18度，低转速（140-180rpm），

诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意:

1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。

葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。

2.保种可以取一部分分成50μl一管，每次用一管，避免反复冻融。

8、包涵体检测。

方案见附件2

9、如有上清表达，则扩大摇菌。

1）取保种的表达菌株先摇10ml，37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种

的活性而异，也可过夜摇菌。

2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度，250rpm摇至OD=1.0左右（约

2.5h~3h），然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。

）注:

菌液浓度要适当

的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。

另一方法是，将手指放在瓶底

晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。

3）过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18?

左右），转速140rpm左右。

4）将菌液6000rpm，4min，4度离心收集菌体。

加入20mMPBS，洗一遍后用平衡缓

冲液重悬。

每250ml菌液用30ml到50ml平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。

可用

4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。

10、超声波裂解。

1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。

注意:

1.要冰浴。

2.要随时观察裂解情况以防意外。

3.要将探头探入到溶液中下部，

尽量不要打出大量气泡。

一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。

4.正常声音为:

孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头

松动等原因，要及时调整。

溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后

面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。

5.超声波破碎仪工作30分min要休

息5min（即关闭总电源开关）。

注意:

1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂

（PMSF），PMSF工作浓度为1%。

2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解

60分钟，60分钟足够裂解。

11、取得上清

1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。

10000rpm，15min，4?

离心。

沉淀为包涵

体、细胞碎片和未破碎的细胞。

轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。

（此时可

以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。

平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后

上清就会在7.5左右。

）

12、纯化上清---摸洗脱条件。

1）镍柱处理。

将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。

（若是流

速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。

）取20μl过柱后

的样品，以备跑胶。

3）分别加20mM、40mM、60mM、80mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。

每个梯度分别

的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。

每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别

收集入EP管中，以备跑胶。

注意:

理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行

下一个梯度的洗脱。

实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗

脱了。

4）加ElutionBuffer将目的蛋白洗脱。

上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP

管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。

5）加MES将NI柱重生。

MES加10ml，流完后再加10mlMiliqHO。

流完后保存于22

倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。

（尿素可能对NI柱有损伤。

）注意:

所有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱及洗脱影响较大。

镍柱所用溶液MES的ph=5.0，其余EquilibrationBufferpH=7.8，上清pH=7.5，WashBufferpH=7.0，ElutionBufferpH=7.2。

13、跑胶验证。

1）跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相

同两块胶才会比较一致。

）跑胶顺序:

负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、2

W7、W8、W9、E1、E2、MES

3）300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右。

（也可以300V,30min，只是

图没有160V好看。

）

4）考马斯亮蓝染色。

一般染色2h即可。

5）脱色。

先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。

14、纯化上清---收集目的蛋白

1）将重生的镍柱再次平衡（即加EquilibrationBuffer3ml）。

2）重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

15、跑胶验证。

同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V），保存好。

16、透析。

1）配制2L透析液（配方见附件1），并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQHO充分洗净。

23）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其

中，置入提前预冷的500ml透析液（20mMPBS+50mMNaCl）中。

冰浴下轻微磁力

搅拌20min后置入4?

冰箱1.5h后换液。

透析3次即可。

注意:

用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。

冰浴以防活性降低。

17、浓缩。

1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。

2）30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇。

3）每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。

4）透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4?

存放。

注意:

浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状，

透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。

如果看不到，可根据自己估

计的蛋白量留1-2ml体积。

用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶

液分装后-20度保存。

18、超滤法浓缩、透析蛋白。

使用超滤法就可省去16、17两步。

1）将4mlElution得到的蛋白溶液加入超滤管中。

2）配平。

3）7400g，30min，4?

离心，结束时4ml变为1ml左右。

浓缩4倍。

可根据需要选择

不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。

可以几次的Elution液一起浓缩。

4）加入需要的蛋白储存液至4ml，离心。

重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋

白储存液。

蛋白储存液一般用20mMPBS+*mMNaCl或适当浓度和pH的tris-HCl

溶液。

如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。

5）收集。

将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白

浓度（测量后），制备日期。

注:

超滤管的使用方法见附件4

19、蛋白浓度测定。

见附件3

20、蛋白活性测试。

转染细胞测量荧光。

21、抗原处理。

蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。

22、注射兔子。

选择合适的注射方式和合适的免疫程序。

23、收集免疫血清。

提取抗体。

24、抗体效价评定。

附件1

所需溶液配方:

1）20mMPBS:

20mMsodiumphosphate,300mMNaClpH7.4

试剂名称NaHPO-2HONaHPO-12HONaCl242242

用量（g）1L0（59285.80219217.532

2）EquilibrationBuffer（平衡缓冲液）:

PBSwith10mM咪唑pH7.43）WashBuffer（清洗缓冲液）:

PBSwith25mM/50mM/75mM咪唑pH7.44）ElutionBuffer（洗脱缓冲液）:

PBSwith250mM咪唑pH7.45）MES（再生缓冲液）:

20mM2-（N-morpholine）-ethanesulfonicacid,0.1Msodium

chloride;pH5.0。

即0.3904gMES+0.5844gNaCl.6）透析袋处理液:

2%（w/v）碳酸氢钠和1mmol/L（pH8.0）EDTA7）透析液:

20mMPBS+50mMNaCl（2.92g）

试剂名称NaHPO-2HONaHPO-12HONaCl242242

用量（g）1L0（59285.8021922.92g

TIPS:

1—4的溶液可以一起配制。

先配10ml8M的咪唑。

再配1L的PBS，用500ml水将

试剂溶解，取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为WashBuffer、ElutionBuffer和EquilibrationBuffer，再向其分别加入适当体积的8M咪唑。

最后，定容。

WashBuffer、ElutionBuffer各配了100ml，EquilibrationBuffer配了300ml。

PBS配了500ml。

附件2

包涵体检测

1.摇10ml菌，加0.5%葡萄糖和相应抗性。

培养至OD600=0.5后离心加入新的培养基和相

应浓度的IPTG低温（16-25度）诱导过夜（也可不离心,在原来LB中直接加IPTG）。

在

离心前取500μl菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。

正负对照不用

超声波裂解，直接煮沸10min跑胶。

2.诱导完成后，用2mlEP管6000rpm，2min，4度，收集10ml菌液。

1.5mlPBS（50mM

PBS,300mMNaCl）重悬细菌。

3.裂解细胞。

用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般15到30min。

裂解3s，停止6s，

裂解时冰上放置。

4.分离上清。

5000rpm，4min，4?

除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。

然后，10000rpm，

10min，4度。

取上清于新的1.5mlEP管中。

取其中的20微升于200微的EP管中，加5

微5*SDSloadingbuffer混匀，煮沸10min。

5.重悬包涵体。

用1000微PBS震荡重悬包涵体，取20微于200微的EP管中加5微

5*SDSloadingbuffer，煮沸10min。

6.正负对照的收集。

离心收集正负对照菌体，0.5ml上清留下40μl,加入10μl5*SDSloading

buffer,煮沸10min裂解。

7.跑聚丙烯酰胺凝胶。

将正负对照及实验样品一起跑胶。

一般顺序是:

-,+,上清,包涵体.

附件3

蛋白浓度定量测试方案

1（将染色剂稀释。

稀释5倍，取4ml染色剂于50ml离心管中，加16mlmiliqHO.充分溶解后用0.44μm2

的滤膜过滤于另50ml离心管中。

（此剂量可测4个样品。

）

2（牛血清白蛋白（BSA）标准品的制备

1）将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml，分装为400-500μl/支（可以

室温放置60天，-20度长期保存）。

2）将1mg/ml的BSA分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml，各180μl，另外加一管水为

零对照。

浓度0.2mg/ml0.4mg/ml0.6mg/ml0.8mg/ml

BSA（1mg）36μl72μl108μl144μl

144μl108μl72μl36μlH2O

3（染色。

1）取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品）1.5mlEP管中。

4个

梯度各做一个重复，共8支，另外加1个样品（或1+n个样品）和1个blank，共10支

EP管（或10+n支），分别对应标记。

2）将30μl样品和30μl标准BSA及30μlH2O分别加入上述EP管中。

涡旋混匀。

3）室温孵育5min到60min。

5min后即开始测量，在60min内测完，越快越好，因为

Absorbancewilincreaseovertime。

4.吸光度的测量。

600nm处测量，并记录吸光度。

注意:

1.blank是染色液加30微升的水。

2.从低浓度测量到高浓度。

根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围，据此决定sample的测量顺序。

5.比色皿的洗涤。

用100%乙醇浸泡洗涤。

6.标准曲线的制作。

利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。

附件4.

4mlmillipore超滤离心管使用注意事项

1.用前用miliq水润湿。

2.4度预冷。

3.离心力不能超过7500g。

加速度设定为8.

4.离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心，以使两膜所受的压力一

致。

5.使用完毕后，用miliq水洗净，加入1ml0.1NNaOH泡24h，后加入1ml20%乙醇保存。

如果要短期保存几天，也可加水浸泡。

附件5

聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法

附件6.

包涵体蛋白的提纯

与提上清中所用试剂不同之处:

在EquilibrationBuffer、WashBuffer、ElutionBuffer中各加了6M尿素或盐酸胍。

尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。

在裂解完后，离心时先3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片，再10000rpm15min离心，沉淀就是包涵体。

用加了6M尿素或盐酸瓜的EquilibrationBuffer溶解包涵体。

后面的步骤跟提上清蛋白一致，只是所用EquilibrationBuffer、WashBuffer、ElutionBuffer中都含有6M尿素或盐酸胍。

另

去盐酸胍后跑胶。

外盐酸胍会与SDS结合形成沉淀，影响跑胶。

这里采用乙醇沉淀法来除

如果要做包涵体，建议用尿素做，因为盐酸胍的毒性较大，必须除去，除去后蛋白可能就析出了。

尿素毒性相对较小，可以不用除去。

这样可以省去很多麻烦。

尿素对包涵体的溶解性不如盐酸胍好，较难溶解，可以用超声波破碎仪帮助溶解:

6mm变幅杆，15%功率，3s/6s，10min左右即可。

也可以加上1%---5%的甘油助溶。

甘油是加在EquilibrationBuffer

中的。

另外，做包涵体可以直接37度快速摇菌，无需低温，加IPTG的时间可以提前到OD=0.6左右。

乙醇法淀蛋白跑SDS-PAGE

1、1.5mlEP管中加150μl蛋白溶液和1350μl100%乙醇，乙醇要-20度预冷，涡旋。

2、-20度放置10min。

4度，15000rpm，10min，小心弃去上清，尽量去干净。

此时管底可

见蛋白沉淀。

3、向管中加30μl1.5*SDS-loadingbuffer。

（这里蛋白溶液已经浓缩了5倍）。

4、上样，跑胶。

如有错误，敬请批评指正。

血清的提取

动物血采集后，室温自然凝固后立即4500g，10min离心，分离出血清。

抗血清保存有三种方法:

第一种是4?

保存，通常可保存3个月,半年，效价高时可保存一年左右;

第二种是-20?

-40?

低温保存，可保存5年左右，但需防止反复冻融;

第三种是真空冰冻干燥保存，可保存5,10年。

注:

耳缘静脉采血，为防止溶血请勿吸取流到外面的血，直接从静脉吸取的血液不会溶血。

总黄酮

生物总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。

在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。

简介

近年来，由于自由基生命科学的进展，使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。

类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。

它们对健康的好处有:

（1）抗炎症

（2）抗过敏（3）抑制细菌（4）抑制寄生虫（5）抑制病毒（6）防治肝病（7）防治血管疾病（8）防治血管栓塞（9）防治心与脑血管疾病（10）抗肿瘤（11）抗化学毒物等。

天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能时入脂肪组织，进而体现出如下功能:

消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。

近年来国内外对茶多酚、银杏类黄酮等的药理和营养性的广泛深入的研究和临床试验，证实类黄酮既是药理因子，又是重要的营养因子为一种新发现的营养素，对人体具有重要的生理保健功效。

目前，很多著名的抗氧化剂和自由基清除剂都是类黄酮。

例如，茶叶提取物和银杏提取物。

葛根总黄酮在国内外研究和应用也已有多年，其防治动脉硬化、治偏瘫、防止大脑萎缩、降血脂、降血压、防治糖尿病、突发性耳聋乃至醒酒等不乏数例较多的临床报告。

从法国松树皮和葡萄籽中提取的总黄酮"碧萝藏"--（英文称PYCNOGENOL）在欧洲以不同的商品名实际行销应用25年之久，并被美国FDA认可为食用黄酮类营养保健品，所报告的保健作用相当广泛，内用称之为"类维生素"或抗自由基营养素，外用称之为"皮肤维生素"。

进一步的研究发现碧萝藏的抗氧化作用比VE强50倍，比VC强20倍，而且能通过血脑屏障到达脑部，防治中枢神经系统的疾病，尤其对皮肤的保健、年轻化及血管的健康抗炎作用特别显著。

在欧洲碧萝藏已作为保健药物，在美国作为膳食补充品（相当于我国的保健食品），风行一时。

随着对生物总黄酮与人类营养关系研究的深入，不远的将来可能证明黄酮类化合物是人类必需的微营养素或者是必需的食物因子。

性状:

片剂。

功能主治与用法用量

功能主治:

本品具有增加脑血流量及冠脉血流量的作用，可用于缓解高血压症状（颈项强痛）、治疗心绞痛及突发性耳聋，有一定疗效。

用法及用量:

口服:

每片含总黄酮,,,,，每次,片，,日,次。

不良反应与注意

不良反应和注意:

目前,暂没有发现任何不良反应.

洛伐他丁

【中文名称】:

洛伐他丁

【英文名称】:

Lovastatin

【化学名称】:

（S）-2-甲基丁酸-（1S,3S,7S,8S,8aR）-1,2,3,7,8,8a-六氢-3,7-二甲基

-8-[2-（2R,4R）-4-羟基-6氧代-2-四氢吡喃基]-乙基]-1-萘酯

【化学结构式】:

洛伐他丁结构式

【作用与用途】洛伐他丁胃肠吸收后，很快水解成开环羟酸，为催化胆固醇合成的早期限速酶（HMG,coA还原酶）的竞争性抑制剂。

可降低血浆总胆固醇、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的胆固醇含量。

亦可中度增加高密度脂蛋白胆固醇和降低血浆甘油三酯。

可有效降低无并发症及良好控制的糖尿病人的高胆固醇血症，包括了胰岛素依赖性及非胰岛素依赖性糖尿病。

【用法用量】口服:

一般始服剂量为每日20mg，晚餐时1次顿服，轻度至中度高胆固醇血症的病人，可以从10mg开始服用。

最大量可至每日80mg。

【注意事项】?

病人既往有肝脏病史者应慎用本药，活动性肝脏病者禁用。

?

副反应多为短暂性的:

胃肠胀气、腹泻、便秘、恶心、消化不良、头痛、肌肉疼痛、皮疹、失眠等。

?

洛伐他丁与香豆素抗凝剂同时使用时，部分病人凝血酶原时间延长。

使用抗凝剂的病人，洛伐他丁治疗前后均应检查凝血酶原时间，并按使用香豆素抗凝剂时推荐的间期监测。

他汀类药物

他汀类药物（statins）是羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶（HMG-CoA）还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面（主要为肝细胞）低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein，LDL）受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。

他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌。

他汀类药物分为天然化合物（如洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀）和完全人工合成化合物（如氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、罗伐他汀、pitavastatin）是最为经典和有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗。

他汀类药物除具有调节血脂作用外，在急性冠状动脉综合征患者中早期应用能够抑制血管内皮的炎症反应，稳定粥样斑块，改善血管内皮功能。

延缓动脉粥样硬化（AS）程度、抗炎、保护神经和抗血栓等作用。

结构比较

辛伐他汀（Simvastatin）是洛伐他汀（Lovastatin）的甲基化衍化物。

美伐他汀（Mevastatin，又称康百汀，Compactin）药效弱而不良反应多，未用于临床。

目前主要用于制备它的羟基化衍化物普伐他汀（Pravastatin）。

体内过程

洛伐他汀和辛伐他汀口服后要在肝脏内将结构中的其内酯环打开才能转化成活性物质。

相对于洛伐他汀和辛伐他汀，普伐他汀本身为开环羟酸结构，在人体内无需转化即可直接发挥药理作用，且该结构具有亲水性，不易弥散至其他组织细胞，极少影响其他外周细胞内的胆固醇合成。

除氟伐他汀外，本类药物吸收不完全。

除普伐他汀外，大多与血浆蛋白结合率较高。

用药注意

大多数患者可能需要终身服用他汀类药物，关于长期使用该类药物的安全性及有效性的临床研究已经超过10年。

他汀类药物的副作用并不多，主要是肝酶增高，其中部分为一过性，并不引起持续肝损伤和肌瘤。

定期检查肝功能是必要的，尤其是在使用的前3个月，如果病人的肝脏酶血检查值高出正常上线的3倍以上，应该综合分析病人的情况，排除其他可能引起肝功能变化的可能，如果确实是他汀引起的，有必要考虑是否停药;如果