A549DDP细胞凋亡与其机制的研究.docx

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A549DDP细胞凋亡与其机制的研究

A549/DDP细胞凋亡及其机制的研究

1材料

1.1主要仪器

荧光显微镜及照相系统：

Olympus公司

垂直电泳槽：

Bio-Rad公司

电转移槽：

Bio-Rad公司

恒温摇床：

江苏太仓仪器公司

分光光度仪：

Bio-Rad公司

遥控酶标仪：

TECAN公司

台式高速离心机：

eppendorf公司

其余同前两部分

1.2普通耗材

50mL/250mL细胞培养瓶：

Nunc公司

6孔细胞培养板：

Costar公司

60mm细胞培养皿：

Costar公司

细胞刮刀：

Nunc公司

1.3主要试剂

Hoechst33258染色试剂盒：

碧云天公司

PI和AnnexinV-FITC：

美国BD公司

TUNEL试剂盒：

罗氏公司

鼠抗人Caspase-8p10单抗：

CellSignaling

HRP标记羊抗鼠二抗：

武汉博士德公司

BCA法蛋白定量试剂盒：

Pierce公司

ECL发光检测试剂盒：

Pierce公司

硝酸纤维素转移膜（0.22μm）Amersham公司

DAB北京中杉公司

其余试剂同前两部分

1.4常用缓冲液及培养基

结合缓冲液（×10）：

100mmol/LHEPES（PH7.5）

1.4moLNaCl

25mmol/LCaCl2

单去圬剂裂解液：

50mmol/LTris-HCl（PH8.0）

150mmol/LNaCl

1%TritonX-100

100g/mLPMSF

5×SDS蛋白上样缓冲液：

250mmol/LTris-HCl（PH6.8）

10%SDS

50%甘油

0.5%溴酚蓝

500mmol/LDTT（临用前现加）

电泳缓冲液：

25mmol/LTris-HCl（PH7.4）

250mmol/L甘氨酸（PH8.3）

0.1%SDS

转移缓冲液：

5.6mmol/LTris-HCl（PH7.4）

120mmol/L甘氨酸

0.1%SDS

20%甲醇（V/V）

储存于4℃备用

PBS缓冲液

137mmol/LNaCl

2.7mmol/LKCl

10.0mmol/LNa2HPO4

2.0mmol/LKH2PO4

调节至PH=7.4

洗涤缓冲液（PBS-Tween-20）：

1000mLPBS（PH7.4,0.01M）

500μLTween-20

封闭缓冲液：

5g脱脂奶粉

100mLPBST

1.5细胞系

同第一部分

2方法

2.1A549/DDP细胞凋亡的检测

2.1.1细胞凋亡形态学观察

将A549/DDP细胞分别加入到含盖玻片的6孔细胞培养板中，每孔细胞数为1×104个，培养过夜后，去培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液继续培养24h后终止培养，取出细胞爬片，按照Hoechst33258染色试剂盒说明书进行染色。

①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定10分钟。

②去固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。

③加入0.5mLHoechst33258染色液，染色5分钟，用手晃动数次。

④去染色液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。

⑤滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，避免气泡。

⑥上荧光显微镜观察，激发波长350nm，发射波长460nm。

2.1.2原位末端标记（TUNEL）染色

同上方法制备细胞爬片，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定后，按照TUNEL

试剂盒说明书操作。

①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定30分钟。

②PBS洗片两次，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。

滴加内源性过氧化物酶阻断剂（0.3%H2O2-甲醇溶液），室温孵育30分钟。

③同上用PBS洗片，滴加通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%枸橼酸钠溶液中），在冰浴中孵育2分钟。

④PBS洗两次，滴加50μL的TUNEL反应混合液，湿盒中室温孵育60分钟。

⑤PBS洗两次，滴加50μL的转化剂-POD，湿盒中37℃孵育30分钟。

⑥PBS洗两次，加入DAB底物溶液，室温孵育10分钟。

⑦PBS洗两次，封片。

光镜下观察。

⑧结果判定：

细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。

每张片至少观察500个细胞，计算每100个细胞内的阳性细胞，即凋亡指数（apoptoticindex,AI）。

2.1.3流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡

①取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液。

②接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL，细胞培养箱中过夜培养。

③次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液，继续培养24h。

④常规消化，4℃离心（800rpm,5min），收获各组细胞，转移至1.5mL离心管。

⑤弃上清，加入预冷的1×结合缓冲液100μL，重悬细胞，置于冰浴。

⑥加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI于细胞悬液中，混匀，4℃避光染色10min。

⑦补加490μL结合缓冲液混悬细胞，立即行FCM分析。

2.2姜黄素对A549/DDP细胞caspase-8的影响

取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液，接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL，细胞培养箱中过夜培养。

次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液，继续培养24h。

2.2.1样品制备

①提取细胞总蛋白：

a.培养液中悬浮细胞蛋白的提取：

各浓度姜黄素处理细胞24h后，终止培养。

将培养皿中的培养液转移至15mL塑料离心管中，4℃，2500rpm离心10min，弃上清，4℃1×PBS洗涤两次，加入单去污剂裂解液100μL于冰上裂解30min，将上清转移至1.5mL塑料离心管，备用；

b.贴于培养皿上细胞蛋白的提取：

4℃1×PBS洗涤培养皿两遍，加入单去污剂裂解液300μL于冰上裂解30min。

裂解完毕后，用细胞刮片将细胞刮于一侧，转移至1.5mL塑料离心管中，4℃，12000rpm离心10min。

c.将离心后的上清液与从a中得到的裂解上清混合，4℃，12000rpm离心5min，取上清分装于0.5mL离心管中，置于－20℃备用。

②BCA法蛋白定量。

③取总蛋白含量相等的上清体积，加入1/5体积的5×SDS上样缓冲液，沸水煮5min，12000rpm离心10min，备用。

2.2.2电泳

采用微型垂直蛋白电泳系统进行SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲系统为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

先后配制10%的分离胶及4%的浓缩胶，凝固后用微量加样器向加样槽中加入样品和次高分子量蛋白质标准，电泳装置与电源相连，凝胶上所加电压120V，当染料前沿进入分离胶后，把电压提至160V，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电源。

2.2.3转移

将电泳后的SDS-PAGE胶板置于转移缓冲液中平衡15min，再在转移缓冲液中进行电转移；将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，恒压60V，冷却系统中转移2h。

转移完成后将膜在丽春红染液中染色，观察电转结果。

剪下目的蛋白部分，做好标记，放入双蒸水中漂染，褪去染液颜色。

2.2.4Westernblot

①封闭：

将膜置于平皿中，加入封闭液于室温缓慢摇动1h。

②与一抗孵育：

将鼠抗人Caspase-8p10单抗及β-actin作为一抗用PBS稀释（1:

1000），与膜共同封入塑料袋中，4℃过夜。

③洗膜：

将膜从塑料袋中取出，PBST振摇漂洗3次，每次10min。

④与二抗孵育：

将HRP标记羊抗鼠抗体作为二抗用PBST稀释（1:

3000），与膜共同封入塑料袋中，室温缓慢摇动1h。

⑤洗膜：

同③。

⑥化学发光：

将膜上液体用滤纸吸干，置于化学发光底物反应系统中反应5min，暗室X-光片1~5min。

显影20sec，定影10min.

⑦扫描后，用LeicaQwin图象分析软件进行吸光度积分值分析。

2.3统计学处理

用SPSS11.0统计软件包处理，统计学方法采用单因素方差分析，SNK-q检验，x2检验，P＜0.05认为有统计学意义。

3结果

3.1A549/DDP细胞凋亡的检测

3.1.1细胞形态学改变

荧光显微镜下观察，姜黄素组部分细胞的细胞核均有破裂，呈大、小不等，被荧光染料着色成致密浓缩发白发亮的细胞核，此为典型的细胞凋亡形态。

其中以40μmol/L姜黄素组最多，对照组只见很少凋亡形态细胞（附图1）。

3.1.2TUNEL检测细胞凋亡指数

原位DNA缺口末端标记染色，凋亡细胞核呈棕黄色，易于识别（附图2）。

0，5、l0、20、30、40μmol/L的姜黄素作用于A549/DDP细胞24h后，凋亡指数分别是（2.6±0.5）%、（10.7±2.3）%、（20.5±3.1）%、（28.6±3.4）%、（35.7±0.4）%、（49.5±4.4）%，显示出明显的剂量依赖关系（P＜0.05）。

3.1.3流式细胞仪检测细胞凋亡率

不同浓度姜黄素作用于A549/DDP细胞24h后，经Annexin-V和PI进行染色后，用流式细胞仪分析凋亡细胞。

流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图（图5）。

第1象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞（An-PI+），第2象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞（An+PI+），第3象限代表正常细胞（An-PI-），第4象限代表早期凋亡细胞（An+PI-）。

本实验主要观察早期凋亡细胞，早期凋亡细胞即An+PI-细胞所占的百分比分别为2.93%、3.68%、7.71%、20.23%、23.0%、32.15%，显示出明显的剂量依赖关系（P＜0.05）。

3.2Westernblot的结果

不同浓度姜黄素处理A549/DDP细胞24h后，出现Caspase8活性裂解片段P10的蛋白条带（附图3），且条带光密度积分值随姜黄素浓度而增强（图6）。

4讨论

细胞凋亡是细胞生物体的一种重要的自稳机制，是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。

研究表明，肿瘤的发生很可能就是由于细胞增殖和凋亡失衡，导致肿瘤细胞无限无序增殖所致。

诱导肿瘤细胞凋亡是许多抗癌成分十分重要的抗癌机制之一。

肿瘤化疗过程中，凋亡细胞很快被体内的巨噬细胞清除，对周围的炎症反应很少。

因此通过诱导凋亡而杀死肿瘤细胞具有更少的毒副反应，目前通过诱导或促进肿瘤细胞凋亡正成为肿瘤防治的新思路，也是评估抗癌药物作用能力的重要指标。

细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst染色细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

本部分实验中，经过不同浓度姜黄素干预24h后的各组细胞，用Hoechst33258荧光染料染色后，在荧光显微镜下观察，姜黄素干预组均能找到较多胞核致密浓缩发白发亮的细胞，并随着姜黄素浓度增加而增多，而对照组只见很少呈凋亡形态的细胞，这表明姜黄素可诱导A549/DDP细胞凋亡。

细胞凋亡时DNA断裂会产生大量游离的3’-羟基末端，利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT），无需DNA模板即可将生物素或地高辛标记的外源性dUTP直接连接到凋亡细胞核的DNA断链的3’-羟基末端，通过过氧化物酶标记的链卵白素或抗地高辛抗体与之结合，经DAB显色，检测细胞细胞是否存在外源性核苷酸掺入的DNA片段，显示凋亡细胞。

利用该技术能较准确地探测到细胞凋亡现象。

本部分实验中，TUNEL结果示5μmol/L姜黄素作用24h即有被标记染色阳性的细胞出现，凋亡指数为（2.6±0.5）%，与对照组相比有显著性差异。

随着剂量增大，凋亡指数增多，凋亡细胞占总细胞数的比例升高。

并且阳性细胞数随药物浓度递增。

流式细胞仪检测凋亡的方法有多种，其中磷脂结合蛋白AnnexinV-FITC/PI双标记染色最为常用。

正常活细胞带负电的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）定位于细胞膜内侧。

细胞凋亡早期，由于细胞膜失去对称性，PS从胞膜的内侧暴露于胞膜外，成为巨噬细胞清除凋亡细胞识别的标志。

AnnexinV-FITC是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白，与PS有很强的亲和力，可特异地与PS结合。

凋亡早期细胞仍保持膜的完整性，PI不能进入细胞内，而凋亡晚期和发生继发坏死的细胞可同时被AnnexinV-FITC/PI着色，利用流式细胞仪进行双参数分析，即可将凋亡细胞（AnnexinV+细胞）与继发坏死的细胞（AnnexinV+/PI+细胞）区分开，并能计算出阳性细胞百分率。

本部分实验中，FCM分析显示姜黄素作用于A549/DDP细胞24h后，实验组的细胞早期凋亡率即明显高于阴性对照组，且呈剂量依赖性，这进一步证明姜黄素可以诱导A549/DDP细胞凋亡。

综上，本文从细胞形态，TUNEL检测，流式细胞仪分析等三个不同层面证实了姜黄素可以诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡，并呈剂量依赖性，该凋亡的发生应该是姜黄素抗A549/DDP细胞增殖的主要途径。

目前认为细胞凋亡通路主要有：

细胞外（死亡受体）途径、细胞内（线粒体）途径和内质网途径，而天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl

aspartate-specificprotease,caspase）的活化是不同细胞凋亡途径中共同的下游事件，活化后的caspase通过切断与周围细胞的联络、重组细胞骨架、阻止DNA复制和修复、破坏DNA和核结构、诱导凋亡小体的形成等调控着细胞的凋亡过程。

其中caspase-8在细胞凋亡中起着极其重要的作用。

caspase-8在caspase级联反应中属于启动性caspases，caspase-8的活化是caspase级联反应的第一步。

caspase-8除了能启动细胞外途径以外，还能启动细胞内途径，因此caspase-8也是联系内外源凋亡途径的桥梁。

Karmakar等研究发现，姜黄素可通过死亡受体介导途径和线粒体介导途径诱导人恶性胶质瘤T98G细胞凋亡，包括caspase8的活化。

caspase8在正常状态下是以酶原（procaspase8）形式存在的，凋亡信号刺激下，被剪切激活释放出活性片段p18和p10，接着形成有两个大亚基和两个小亚基构成的四聚体，即caspase-8，并从死亡信号复合体（DISC）中释放进入胞浆，继而再活化胞浆中的下游caspase，形成caspase级联反应，将凋亡信号传至凋亡底物，最终发生凋亡。

本研究中western-blot结果显示在姜黄素处理组，均可见caspase-8p10条带，并随浓度增加条带光密度积分值逐渐升高。

说明姜黄素诱导A549/DDP细胞凋亡过程中存在caspase8的活化，但是否存在不依赖caspase的凋亡途径还不得而知。

有研究表明，A549/DDP细胞之所以耐药，与细胞过度表达bcl-2而下调了caspase-8和细胞色素C的蛋白表达有关。

因此姜黄素是否是通过抑制A549/DDP细胞bcl-2过度表达，而上调procaspase-8和细胞色素C蛋白表达，再去激活caspase-8诱导凋亡，还需进一步探讨。