微生物发酵工艺.docx
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微生物发酵工艺
微生物发酵工艺
第六章微生物发酵制药工艺
6.1微生物发酵与制药
6.2微生物生长与生产的关系
6.3微生物生产菌种建立6.4发酵培养基制备
6.4发酵培养基制备
•概念（medium）供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要
的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。
•培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。
6.4.1培养基的成分
碳源
氮源无机盐水生长因子
前体与促进剂
消泡剂
1、碳源（carbonsources）
概念：
构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。
作用：
为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架。
碳源种类
糖类：
葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜
脂肪：
豆油、棉籽油和猪油醇类：
甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：
蛋白胨、酵母膏速效碳源：
糖类、有机酸
迟效碳源：
酪蛋白水解产生的脂肪酸
2、氮源（nitrogensources）
概念：
构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。
作用：
为生长和代谢主要提供氮素来源。
种类：
无机氮源、有机氮源
有机氮源
几乎所有微生物都能利用有机氮源
黄豆饼粉、花生饼粉
棉籽饼粉、玉米浆、蛋白\胨、酵母粉、尿素
无机氮源
氨水、铵盐和硝酸盐等。
氨盐比硝酸盐更快被利用。
工业应用：
主要氮源或辅助氮源；调节pH值生理酸性物质：
代谢后能产生酸性残留物质。
（NH4）2SO4利用后，产生硫酸
生理碱性物质：
代谢后能产生碱性残留物质。
硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。
3、无机盐和微量元素
•概念：
组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质
•作用方式：
低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。
•种类：
盐离子
磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加
铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。
4、水
菌体细胞的主要成分。
营养传递的介质。
良好导体，调节细胞生长环境温度。
培养基的主要成分之一。
5、生长因子（growthfactor）
概念：
维持微生物生长所必需的微量有机物，不起碳源和
氮源作用。
种类：
维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。
天然成分中含有：
一般无需添加。
营养缺陷型菌株：
必需添加。
6、前体（precursor）
•概念：
加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到目标产物分子中，而自身的结构无多大的变化。
•使用：
添加前体是提高抗生素产量的重要措施。
多次少量流加的工艺。
6、促进剂（accelerant）
•概念：
促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前体的一类化合物。
•种类：
氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。
表面活性剂吐温、清洗剂，脂溶性小分子化合物等，
起诱导作用。
7、消沫剂（defoamingagent）
•概念：
降低泡沫的液膜强度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。
•种类：
表面活性剂，低表面张力。
天然动植物油脂类、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类）。
•作用：
消除泡沫，防止逃液和染菌。
6.4.2培养基种类及其质量控制技术
培养基的种类
按用途：
选择性、鉴别性、富营养培养基等按物理性质：
固体，半固体、液体培养基
按化学组成：
合成、半合成、天然培养基
按发酵过程中所处位置和作用：
斜面或平板固体、
种子、发酵和补料培养基。
1、固体培养基
•概念：
（solidmedium）
细菌和酵母的固体斜面或平板培养基，链霉菌和丝状真菌的孢子培养基。
•制备：
液体培养基添加1.0-2.0%琼脂粉。
•作用：
提供菌体的生长繁殖，形成孢子。
1、固体培养基－要求与质量控制
•单细胞培养基：
营养丰富，满足菌体生长迅速，不能引起变异。
•孢子培养基：
基质浓度较低，无
机盐浓度适量，以利于孢子形成。
营养不宜太丰富，否则不易产生孢
子。
2、种子培养基
•概念：
（seedmedium）供孢子发芽和菌体生长繁殖，摇瓶和
作用：
种子罐培养基,为液
体。
使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、健康和高活性的种子。
2、种子培养基－要求与质量控制
用速效性、容易被利用的碳、
培养基成分必需完全，营养丰富。
氮源和无机盐等物质，但浓度
不宜高。
种子培养基要与发酵培养基相适应，主要成分接近，不能差异太大。
缩短发酵的延滞期。
3、发酵培养基
•概念：
（fermentationmedium）提供微生物生长、目标
产物生成的
生产用培养基。
作用：
不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成目标产物，是发酵生产中最关键和最重要的培养基。
要求•营养物质浓度和粘度适中
•组成上丰富完整
•不同菌种和不同产物，对培养基
的要求差异很大，
组成和配方需要优化
4、补料培养基（fedmedium）
•概念：
发酵过程中添加补充的培养基。
•作用：
稳定工艺条件，延长发酵周期，提高目标产物产量•组成：
各种必要的营养物质，碳源、氮源、前体
•制备：
按单一成分配制，各自独立控制，或按一
定比例制成复合补料培养基。
5、控制发酵培养基质量
（1）控制水质：
恒定水源和恒定的水质。
地下深层井水，对水质定期化验检查，使用符合要求的水质配制各种培养基
措施：
检测与控制水质参数
pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度、各种矿物，特别是重金属的种类和含量。
（2）控制培养基原料的质量：
来源与种类的选择农产副品：
因品种、产地、加工、贮存条件不同而质量差异较大。
化学原料：
杂质含量也不相同。
措施：
保持稳定的原料来源。
更换原料时，必需再进行一系列试验，确保产量和质量的控制和稳定性。
原料的选择试验：
不同碳源、氮源对菌种生长的能力和产物的生产能力很不相同。
对原料进行试验，选择满足发酵要求的来源。
注意：
������������碳氮浓度与配比：
适宜
������速效和缓效成分相互配合，发挥综合优势
pH：
配制时加入酸碱性物质搭配，甚至使用缓剂。
（3）控制培养基的黏度：
对发酵的影响：
•高黏度的培养基，不易彻底灭菌•影响发酵的通气搅拌等物理过程•直接影响菌体对营养的利用•目标产物的分离提取造成困难
措施：
固体不溶性成分，淀粉、黄豆粉等增加培养基的黏度，酶水解，降低大分子物质
（4）控制灭菌操作：
高压蒸气灭菌影响培养基的有效成分甚至是活性。
较高温度下长时间灭菌，营养成分会破坏，甚至产生有毒物质。
磷酸盐与碳酸钙、镁盐、铵盐也能反应，生成沉淀或络合物，降低利用度。
维生素等不耐高温分解破坏、失活。
6.4.3制药生产用培养基的配制
一般设计原则
设计思路计算与定量配制优化
1、培养基设计一般原则
•生物学原则：
根据不同微生物营养和反应需求设计。
营养物质组成：
较丰富，浓度适当。
成分之间比例：
恰当，C/N比适宜，有机和无机氮原料之间：
不能产生化学反应。
适宜的pH和渗透压•工艺原则：
不影响通气搅拌、分离精制和废物处理，过程容易控制。
•低成本原则：
原料来源方便，质量稳定，质优价廉。
•高效经济原则：
满足菌体生长和合成产物的需求，最高得率，最小副产物。
2、培养基设计基本思路
•起始培养基：
根据他人的经验和使用。
•单因素实验：
确定最适宜的培养基成分。
•多因素实验：
各成分之间最佳配比和浓度优化。
•中试放大试验：
摇瓶、小型发酵罐，到中试，最后放大到生产罐。
•综合考虑各种因素，产量、纯度、成本等后，确定一个适宜的生产配方。
3、理论计算与定量配制
•微生物生长和生产可用下列表达式表示：
碳源和能源＋氮源＋其他营养物质→细胞＋产
物＋CO2＋H2O＋热量
•单位细胞生物量所需最小的营养物质:
•单位产量的最小底物浓度:
碳源和氮源进行转化率计算和分析
•初步计算：
参考微生物的化学和元素组成。
•转化率：
单位质量原料生产的产物量或细胞量。
•理论转化率：
根据代谢途径的物料衡算
•实际转化率：
发酵过程中实际测量数值计算。
•目标：
使实际转化率靠近理论转化率。
无法从生化反应原理来推断和计算出最佳培养基配方根据生理学和生物化学理论参照前人所用的经验培养基
结合菌的特殊生物学和产品特征要求
进行大量细致和周密的试验研究
小结
培养基组成与作用：
C、N、无机盐、水、生长因
子、前体与促进剂、消泡剂
培养基制备与质量控制：
固体、种子、发酵培养基生产用培养基制备：
原则、思路、优化
思考题
（1）培养基组成成分有哪些，有何作用？
（2）固体培养基、种子培养基、发酵培养基的组成特点及其如何衔接？
（3）如何研制生产用培养基？
第六章微生物发酵制药工艺
6.1微生物发酵与制药
6.2微生物生长与生产的关系
6.3制药微生物生产菌种建立
6.4培养基制备
6.5灭菌工艺
6.5灭菌工艺
灭菌方法与原理
培养基灭菌工艺
空气除菌工艺
几个概念
杂菌：
除生产菌以外的任何微生物。
污染：
感染杂菌的培养或发酵体系。
•消毒：
杀灭或清除病原微生物，达到无害化程
度，杀灭率99.9%以上。
•杀菌：
杀灭或清除一切微生物，达到无活微生
物存在的过程，杀灭率99.9999%以上。
•灭菌：
微生物杀灭率99.999999%以上。
6.5.1灭菌方法与原理
1、化学灭菌2、物理灭菌
1、化学灭菌
用化学物质杀灭微生物的灭菌操作。
•化学灭菌剂：
氧化剂类等，卤化物类，有机化合物等。
细胞死亡。
•应用：
皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌区域的台面、地面、墙壁及空间的灭菌。
•机理：
蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，
2、物理灭菌
各种物理条件如高温、辐射、超声波及过滤等进行灭菌•紫外线等射线：
局部空间•干热灭菌：
实验室器皿
•蒸汽灭菌：
培养基
效果好，操作方便，广泛使用。
6.5.2培养基灭菌
1、微生物高温死亡动力学与灭菌的关系微生物受热死亡过程的一级动力学反应：
－dX/dt=kdX
微生物浓度与灭菌时间成正比，浓度越高，灭
菌时间越长。
灭菌时间与比死亡速率之间的关系
kd与微生物种类、生理状态、灭菌温度有关以杀死芽孢的温度和时间为指标。
确保彻底灭菌，实际操作中增加50％的保险系数。
2、培养基灭菌的操作方式
（1）分批灭菌操作，间歇灭菌,实罐灭菌：
配制好培养基输入发酵罐内，直接蒸汽加热，达到
灭菌要求的温度和压力后维持一段时间，再冷却至
发酵要求的温度。
•特点：
不需其他的附属设备，操作简便，手动。
•缺点：
加热和冷却时间较长。
营养成分损失较多，罐利用率低。
适合小批量生产规模。
分批操作的灭菌过程
•加热升温：
•维持灭菌温度：
15－30min，121℃；0.09－0.10MPa•冷却降温：
每段对灭菌的贡献于取决时间长短。
分批灭菌的操作过程
通入蒸汽：
空气管、夹套通入蒸汽。
加热升温：
70℃，取样管、放料管通入蒸汽。
维持保温：
120℃，罐压0.1MPa，排气。
调节进
汽和排气量，维持30min。
冷却降温：
依次关闭排气、进汽阀。
罐压低于空气压力后，通入无菌空气，夹套通入冷却水降温。
（2）连续灭菌操作
高温短时灭菌操作，连消：
培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热
灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。
加热升温、维持灭菌温度和冷却降温三个阶段由不同的设备执行：
加热器，保温设备，冷却器。
（2）连续灭菌操作－流程图培养基与高压蒸汽直接混匀，达到灭菌温度（130－140℃）
（2）连续灭菌－操作过程
配料：
配料罐，配制培养基。
预热罐：
定容和预加热。
70－90℃。
加热器：
培养基与蒸汽混合，快速升到130－140℃。
维持罐：
维持灭菌时间,5－7分钟。
冷却管：
培养基经过冷却水管冷却。
40－50℃。
输入灭菌的发酵罐中。
连续灭菌的特点
1）高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少；
2）热能利用合理，易于自动化控制；
3）不适合粘度大或固形物含量高的培养基灭菌；
4）增加了连续灭菌设备及操作环节，增加染菌几率。
5）对压力要求高，一般为0.45-0.8MPa。
6.5.3空气除菌操作工艺
1、发酵对空气的要求
好氧微生物需要氧气供应，通入空气。
连续一定流量的压缩无菌空气。
空气流量：
一般0.1-2.0。
压强：
0.2-0.4MPa。
空气质量：
相对湿度小于70％；比培养温度高
10－30℃；洁净度100级，或失败率10－3。
2、工业制备大量空气的方法
加热灭菌：
利用空气压缩时所产生的热量除
菌，无菌化程度不高的发酵过程。
静电除菌：
通过高压电流场，带电粒子被吸附。
介质过滤：
捕集粒子及各种微生物。
发酵工业采用。
3、空气除菌原理
空气中附着在尘埃上的微生物大小为0.5-5um。
离心场作用：
颗粒及其微生物沉降
直接被截留：
颗粒惯性碰撞，相互集聚成大颗
粒。
气流速度越大，惯性越大，截留效果越好。
静电引力：
有一定作用。
4、空气过滤介质
膜过滤介质：
孔径小于被截留微生物体积
硝酸纤维酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龙膜，四氟乙烯、
纤维素树脂微孔滤膜。
0.1-0.5um
深层过滤介质：
空隙大于被截留微生物体积。
纤维状或颗粒状：
棉花（50um）、玻璃纤维、活性炭
过滤纸：
超细玻璃纤维纸（1-1.5um）
金属烧结管：
单根或几十根甚至上百根金属微孔滤
管安装在过滤器内。
5、空气灭菌工艺过程
小结
灭菌方法与原理：
化学、物理培养基灭菌：
间歇式，连续操作空气除菌：
过滤除菌工艺
思考题
（1）与灭菌相关的几个概念有何不同？
（2）比较分析培养基的间歇和连续灭菌工
艺的优缺点及操作要点。
（3）空气过滤灭菌的工艺过程及其主要关键点是是什么？
第六章微生物发酵制药工艺
6.1微生物发酵与制药
6.2微生物生长与生产的关系
6.3微生物菌种建立
6.4培养基制备6.5灭菌工艺
6.6培养技术
6.6发酵培养技术
选择合适的培养基；提供适宜的环境条件
微生物发酵工艺过程的三个工段：
种子制备接种发酵培养
6.6.1种子制备
种子的制备：
种子的逐级扩大培养过程。
获得一定数量和质量的纯种过程。
1．孢子制备
种子活化：
将保存菌种接种在固体培养基上，
在适宜条件下培养，恢复其固有生物特性。
放线菌孢子：
采用琼脂斜面培养基。
霉菌孢子：
大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。
细菌：
采用碳源有限而氮源
丰富的配方。
2．生产种子制备
摇瓶种子制备：
母瓶、子瓶。
种子罐种子制备：
一级、二级、三级种子。
种子罐级数：
制备种子需逐级扩大培养的次数确定种子级数的因素:
1、菌种生长特性及菌体繁殖速度：
生长快，少
2、发酵罐的容积：
越大，多
3、产物的品种及生产规模：
越大，多4、所选用工艺条件：
有利于生长的工艺，少
种子扩大培养罐
发酵类型的定义
一级发酵：
将孢子或菌丝接入直接发酵罐
二级发酵：
经过一级种子罐，再到发酵罐；
谷氨酸生产三级发酵：
二级种子扩大培养，经过二次种子罐，再接入发酵罐。
青霉素生产
四级发酵：
三级种子扩
大培养，经过三级种子罐，再到发酵罐。
链霉素生产菌
接种方式
单种法：
一只种子罐接种一只发酵罐。
双种法：
两只种子罐接种一只发酵罐。
倒种法：
从发酵罐中取出一定量发酵液，接种到另一个发酵罐。
6.6.2培养技术
1、固体表面培养技术：
Solidsurfaceculture原始，最早采用。
2、液体深层培养：
Liquidsubmergedculture
主要的发酵培养技术
3、高密度培养（highcelldensityculture）
概念：
菌体浓度（干重）至少达到50g/L以上的一种理想培养，发酵工艺目标和方向明确。
优点:
缩小发酵体积增加表达量成本低，生产率高。
6.6.3发酵培养的操作方式
1、分批式操作；间歇式操作；不连续操作2、流加式操作，补料－分批式操作3、半连续式操作，反复分批式或换液培养4、连续式操作，衡态操作
5、灌流式操作，不断灌注新营养，取出条件培
养基。
1、分批式操作
概念：
培养液一次性装入发酵罐，一次性接种，
经过一段时间培养，一次性卸出全部培养物。
特点：
非衡态过程－发酵体系的组成（基质、产
物及细胞浓度）都随发酵时间而变化。
缺点：
开始时基质浓度很高，到中后期，产物浓度很高，对发酵不利。
辅助时间：
清洗罐，装料、灭菌，时间长。
2、流加式操作
概念：
装入大部分培养液，一次性接种，在培养过程中连续不断补充新培养基，但不取出培养液。
特点：
流加能源和碳源物质及氨水等。
克服了批式的缺点，使生长和生产保持适宜水平。
缺点：
整个发酵体积不断增加
3、半连续式操作
概念：
培养液一起装入发酵罐，一次性接种。
间歇取出部分发酵培养物（带放），同时补充同等数量的新培养基；然后继续培养，直至发酵结束。
特点：
发酵罐内的培养液总体积保持不变
使生长和生产保持适宜水平。
缺点：
丧失部分前体，丧失部分菌体，非生产菌突变
4．连续式操作
概念：
培养液一起装入发酵罐，接种后培养过程
中，不断补充新培养基,同时取出包括培养液和菌
体在内的发酵液，直至发酵结束。
特点：
恒定状态的发酵，发酵罐内体积及其物系的组成将不随时间而变。
培养基连续稳定流加；产物连续稳定收获；提高菌体密度；自动化。
缺点：
时间长，杂菌污染、突变机会增多。
5、灌流（注）式操作
概念：
培养液一起装入发酵罐，接种后培养过
程中，不断补充新培养基，取出部分符合条件培
养基，菌体仍然滞留罐内。
（与半连续培养不同处）
特点：
除去有毒害的代谢物
补充营养物质
小结
发酵培养的基本过程
培养技术:
概念与特点操作方式：
区别，特点
思考题
（1）如何种子罐级数确定？
（2）各种操作方式的异同点，如何选择应用？
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