微生物发酵.ppt

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微生物发酵工程微生物发酵工程2微生物菌种及其复壮与保藏微生物菌种及其复壮与保藏CompanyLogo复习复习现代微生物发酵工程研究的内容现代微生物发酵工程研究的内容1菌种的选育和扩大菌种的选育和扩大2最经济地利用营养物，按需确定培养基最经济地利用营养物，按需确定培养基3灭菌灭菌4微生物在最优条件下产物的大规模生产微生物在最优条件下产物的大规模生产5发酵产物的提取纯化发酵产物的提取纯化6废物的处理、再生和生产环境的净化废物的处理、再生和生产环境的净化CompanyLogo2微生物菌种及其复壮与保藏微生物菌种及其复壮与保藏11工业生产常用的微生物及工业生产常用的微生物及要求要求22菌种的退化与复壮菌种的退化与复壮33菌种的保藏菌种的保藏CompanyLogo2.1工业生产常用的微生物及要求工业生产常用的微生物及要求v1.细菌细菌:

分布最广分布最广,数量最多数量最多,单细胞原核单细胞原核,v二分裂殖二分裂殖.v枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌-淀粉酶、蛋白酶淀粉酶、蛋白酶v嗜热乳杆菌嗜热乳杆菌-乳酸乳酸v醋酸杆菌醋酸杆菌-醋酸醋酸v棒状杆菌棒状杆菌-氨基酸氨基酸v短杆菌短杆菌-肌苷酸肌苷酸v大肠杆菌大肠杆菌-工程菌构建工程菌构建,GABA,AACompanyLogov2.酵母菌酵母菌:

单细胞真核单细胞真核,含糖含糖,偏酸偏酸,腐生腐生,出芽出芽繁殖繁殖,假丝假丝.v啤酒酵母啤酒酵母-酿酒、细胞色素酿酒、细胞色素C、单细胞蛋、单细胞蛋v白、白、甘油、琥珀酸甘油、琥珀酸;v白介素、干扰素白介素、干扰素v假丝酵母假丝酵母-石油脱蜡、饲料石油脱蜡、饲料v类酵母类酵母-脂肪酶脂肪酶CompanyLogov3.霉菌霉菌:

丝状真菌丝状真菌v生产菌种生产菌种:

根霉根霉,毛霉毛霉,犁头霉犁头霉,红曲霉红曲霉,青青霉、曲霉等霉、曲霉等v产品产品:

酶制剂酶制剂;抗生素抗生素;有机酸有机酸;甾体激甾体激素素CompanyLogov4.放线菌放线菌:

原核生物原核生物,有机质丰富的有机质丰富的,微碱性微碱性土壤中土壤中,无性孢子或菌丝片断繁殖无性孢子或菌丝片断繁殖.v生产菌种生产菌种:

链霉菌属链霉菌属;小单孢菌属小单孢菌属;诺卡菌属诺卡菌属等等v产品产品:

链霉素链霉素;红霉素红霉素;金霉素金霉素;庆大霉素等庆大霉素等CompanyLogo纯净纯净健壮健壮产量产量质量质量稳定稳定2易于控易于控制培养制培养条件条件,周期短周期短3对诱变对诱变剂敏剂敏感感4抗污抗污染力染力强强5原料廉原料廉价价,生长生长迅速迅速,目目的产物的产物产量高产量高6不是不是病原病原菌菌1微生物工业对菌种的要求7产物产物分泌分泌型型CompanyLogov菌种退化菌种退化：

生产菌种或选育过程中筛选出来的较优生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良的菌株，由于进行一种传代或保藏之后，群体中良的菌株，由于进行一种传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。

象。

CompanyLogo退退化化的的表表现现产物合成能力下降产物合成能力下降产量下降产量下降发酵力或糖化力降低发酵力或糖化力降低孢子数量变化孢子数量变化菌落大小变化菌落大小变化生长能力和生长速度变化生长能力和生长速度变化CompanyLogov1.菌种退化的原因菌种退化的原因退化原因退化原因基因突变基因突变质粒的脱落质粒的脱落培养和保藏培养和保藏条件的影响条件的影响连续移代连续移代CompanyLogov基因突变导致菌种退化：

基因突变导致菌种退化：

vv自发突变与回复突变自发突变与回复突变10-7-10-9CompanyLogov质粒脱落导致菌种退化：

质粒脱落导致菌种退化：

v控制产量的质粒脱落或核内控制产量的质粒脱落或核内DNA和质粒复制不一致。

和质粒复制不一致。

v连续传代加速退化的发生：

连续传代加速退化的发生：

大量低大量低产突变株产突变株传代传代个别低产突变株个别低产突变株CompanyLogov不良的培养条件不良的培养条件如营养成分、温度湿度、如营养成分、温度湿度、pH值、值、通气量等和通气量等和保藏条件保藏条件如营养、含水量、温度、如营养、含水量、温度、氧气等不仅会诱发低产基因型出现，而且会造氧气等不仅会诱发低产基因型出现，而且会造成低产基因型和高产基因型细胞的数量比发生成低产基因型和高产基因型细胞的数量比发生变化。

变化。

CompanyLogo了解退化的原因了解退化的原因分离纯化分离纯化科学保藏科学保藏减少传代减少传代CompanyLogov2.菌种退化的防止菌种退化的防止尽尽量量减减少少传传代代CompanyLogo2菌种经常纯化菌种经常纯化3创造良好的培养条件创造良好的培养条件4用单核细胞移植传代用单核细胞移植传代5采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法CompanyLogov3.菌种的复壮及其方法菌种的复壮及其方法v复壮原理复壮原理v狭义复壮狭义复壮：

从大量退化的菌株中分离筛选到那些仍从大量退化的菌株中分离筛选到那些仍保持优良性状的个体保持优良性状的个体v广义复壮广义复壮：

在菌种的生产性能尚未退化前就经常有在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行纯种分离与生产性能的测试工作意识地进行纯种分离与生产性能的测试工作CompanyLogo复壮方法复壮方法v平板划线平板划线v稀释分离稀释分离v毛细管分离毛细管分离纯种纯种分离分离v淘汰法淘汰法宿主体宿主体内复壮法内复壮法低温等条低温等条件处理件处理,使部分退使部分退化菌株死亡化菌株死亡寄生性微生物寄生性微生物,可通过接种到可通过接种到的昆虫或动物的昆虫或动物寄主体内以提寄主体内以提高菌株活性高菌株活性CompanyLogov2.3菌种的保藏菌种的保藏一一.菌种保藏菌种保藏v广义：

广义：

在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将它们妥善保管，是指达到不死、不衰、础上，将它们妥善保管，是指达到不死、不衰、不污染以便于研究、交换和使用的目的。

不污染以便于研究、交换和使用的目的。

v狭义狭义：

防止菌种退化、保持菌种的生活能力和优防止菌种退化、保持菌种的生活能力和优良的生产性能，尽量减少、推迟负突变、防止死良的生产性能，尽量减少、推迟负突变、防止死亡，并确保不污染杂菌。

亡，并确保不污染杂菌。

CompanyLogo干燥干燥低营养低营养低温低温CompanyLogo由于各种微生物的生理，遗传特性不同，由于各种微生物的生理，遗传特性不同，适合采用的方法不同适合采用的方法不同v。

v方方法法有效性有效性通用性通用性简便性简便性CompanyLogo干干燥燥3液体液体石蜡石蜡2冻冻干干4真真空空5液液氮氮6斜斜面面1微生物菌种的保藏法CompanyLogo（一一）.斜面保藏法斜面保藏法v特点：

特点：

简便有效，易变异，退化甚至死简便有效，易变异，退化甚至死v亡亡。

v适合：

适合：

不要求长期保藏的及不适合冷冻干不要求长期保藏的及不适合冷冻干v燥的。

燥的。

v保存期保存期:

3个月个月CompanyLogo影响保藏效果因素营养略贫乏营养略贫乏氮源略多氮源略多糖类少糖类少培养基培养基124保存条件保存条件CompanyLogov

（二）

（二）.液体石蜡油保藏法液体石蜡油保藏法v保存期保存期:

2-3年，甚至年，甚至5年传代一次年传代一次.v特别适合特别适合:

在固体培养基上不能形成孢子的丝状担在固体培养基上不能形成孢子的丝状担子菌，如大型食用真菌和药用真菌以及镰刀菌、子菌，如大型食用真菌和药用真菌以及镰刀菌、红曲霉等红曲霉等.v注意：

保藏温度，液体石蜡需灭菌和除水注意：

保藏温度，液体石蜡需灭菌和除水CompanyLogo（三）（三）.干燥保藏法干燥保藏法适于适于:

能产能产生孢子或生孢子或芽孢的微芽孢的微生物生物沙土沙土v麦麸麦麸硅胶硅胶适合产孢子适合产孢子的霉菌和放的霉菌和放线菌线菌适合丝状适合丝状真菌和酵真菌和酵母菌母菌CompanyLogo砂土砂土沙土管沙土管菌种菌种粒度，除钙，除铁及粒度，除钙，除铁及pH。

砂和土混合比例：

。

砂和土混合比例：

1：

1或或3：

2。

121间歇灭菌间歇灭菌3次，每次次，每次1-1.5小时小时埋沙土埋沙土干法干法湿法湿法细胞浓度细胞浓度108-109/ml,0.2-0.3ml/支。

抽真空支。

抽真空干燥干燥4小时小时砂土保藏法砂土保藏法特点特点:

经济简便，保存时间长，不易经济简便，保存时间长，不易变异。

一般变异。

一般2-3年年.CompanyLogov冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法冷冻干燥法:

用保护剂制备菌悬液，用保护剂制备菌悬液，然后将含菌样然后将含菌样快速降至冰冻状态，减压抽真空，使冰升华成水蒸快速降至冰冻状态，减压抽真空，使冰升华成水蒸汽排出，从而使含菌样脱水干燥，汽排出，从而使含菌样脱水干燥，并在真空状态立并在真空状态立即密封瓶口隔绝空气，造成无氧的真空环境，即密封瓶口隔绝空气，造成无氧的真空环境，然后然后置于低温下保存。

置于低温下保存。

v特点特点：

不易发生变异，不易发生变异，5-10年。

需要冻干机。

年。

需要冻干机。

v适用适用：

除了一些不产孢子的丝状真菌外。

除了一些不产孢子的丝状真菌外。

v（四）（四）.冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法CompanyLogoCompanyLogoCompanyLogov1.安剖瓶安剖瓶：

2%盐酸浸泡盐酸浸泡7-10h。

装入标签，装入标签，塞上棉花，灭菌备用。

塞上棉花，灭菌备用。

v2保护剂保护剂：

选择适合的种类选择适合的种类。

CompanyLogo保护剂保护剂减少细胞的减少细胞的损伤和死亡损伤和死亡维持细胞维持细胞的构型的构型重新培养重新培养适宜溶解适宜溶解CompanyLogo成长良好，健壮成长良好，健壮无污染无污染稳定期稳定期高浓度高浓度菌菌种种3.菌种制备菌种制备CompanyLogov预冻：

预冻：

防止泡沫溢出，冻结，升华。

防止泡沫溢出，冻结，升华。

v不低于不低于-20，30min;vv疏松状态时，转入室温抽疏松状态时，转入室温抽1h，融封，融封，检测真检测真v空度，空度，4，避光。

避光。

4.预冻和真空干燥预冻和真空干燥CompanyLogovvv冻干物呈酥块状或松散片状冻干物呈酥块状或松散片状vv真空度接近空载时的最高值真空度接近空载时的最高值vv以等量水作对照以等量水作对照v干燥终止：

干燥终止：

CompanyLogov恢复培养恢复培养：

室温下平衡后，加入最适培养室温下平衡后，加入最适培养v基，控制溶化速度，操作靠近火基，控制溶化速度，操作靠近火v焰。

焰。

v避免：

避免：

样品逸散，污染样品逸散，污染。

CompanyLogov常温下直接真空干燥。

常温下直接真空干燥。

v设备简单，操作方便。

设备简单，操作方便。

v适于适于:

预冻后易受冻伤的菌株预冻后易受冻伤的菌株（五）真空干燥法（五）真空干燥法CompanyLogov以甘油、二甲基亚砜等作保护剂，在液氮超低温下以甘油、二甲基亚砜等作保护剂，在液氮超低温下保藏的方法。

保藏的方法。

v是防止退化的最有效的方法。

是防止退化的最有效的方法。

v适合于各种微生物的保藏。

适合于各种微生物的保藏。

v原理：

原理：

菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来。

v（六）（六）.液氮超低温法液氮超低温法CompanyLogov保护剂：

保护剂：

甘油，二甲基亚砜，糊精，血清蛋甘油，二甲基亚砜，糊精，血清蛋白等。

白等。

vv不同微生物的保护剂不同，需实验确定。

不同微生物的保护剂不同，需实验确定。

v甘油甘油10-20%，二甲基亚砜，二甲基亚砜5-10%v安剖瓶的选择：

安剖瓶的选择：

95料或料或GG17的玻璃管制的玻璃管制成。

成。

液氮超低温法液氮超低温法CompanyLogov菌种制备和冻结保藏：

菌种制备和冻结保藏：

孢子或菌丝体。

孢子或菌