第七章 基因诊断与基因治疗.docx
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第七章基因诊断与基因治疗
第七章基因诊断与基因治疗
一选择题
（一）最佳选择题（每题有五个备选答案，只有一个是正确的，请选出正确答案）
1.有关基因诊断的特点，不正确的是（E）
A.属于病因诊断，针对性强B.特异性高
C.采用分子杂交合PCR技术灵敏度高D.实用性强，诊断范围广
E.不稳定性
2.下列关于分子诊断的描述错误的是（C）
A.采用分子生物学技术进行的诊断B.可进行定性和定量分析
C.蛋白质变化是疾病的直接反应，因此针对蛋白质诊断在分子诊断中最常用
D.可等同于基因诊断，无明显界限E.对象为DNA、RNA或蛋白质三种生物大分子
3.下列疾病不适合基因诊断的是（D）
A.病毒性肝炎B.癌症C.进行性肌营养不良
D.高血压E.肺结核
4.下列关于单链构象多态性分析叙述正确的是（E）
A.是利用突变造成限制性内切酶酶切点改变的方法B.是利用DNA多态性
C.是一种连锁分析D.可找出变异所在E.相同长度单链DNA碱基不同，空间构象不同，电泳的泳动速度不同
5.有关ASO法的描述正确的是（E）
A.仅需要制备一种探针，该探针针对突变位点B.仅用于诊断已知突变
C.仅能检测纯分子D.原理是利用限制性内切酶酶切点的改变
E.仅适用于突变类型较少的遗传病的快速诊断
6.下列一般不用于检测点突变的分子生物学技术室（A）
A.Southern印迹法B.等位基因特异性寡核甘酸分子杂交法（ASO法）
C.基因芯片D.变性高效液相色谱法（DHPLC法）
E.基因测序
8.针对病原体的检测，关于基因诊断较传统方法优越的描述错误的是（D）
A.直接检测病原体遗传物质，灵敏度和特异度高
B.可检测潜伏期的病原体，有利于早诊早治
C.检测成本相对较低，经济有效
D.由于可准确判断病原体的数量，因此可准确预测病情
E.一般无需病原体培养，简便快速
9.基因诊断获得性疾病最常用的方法是（D）
A.基因测序B.基因芯片C.RFLP分析D.ASO法E.PCR技术
10.关于产前基因诊断的描述错误的是（D）
A是产前诊断的水平之一B.可用于检测和控制感染性疾病C.是传统产前诊断的重要补充D.为避免对胎儿的影响，产前基因诊断一般通过分离提取孕妇外周血中胎儿DNA进行检测E.可用于检测三体综合征及地中海贫血等遗传病
11.下列技术中最常用于基因诊断的最常用技术方法（E）
A.基因变异B.基因芯片C.ASO法D.FISH技术E.PCR技术
12.下列何种方法不是用于基因诊断的常用技术方法（C）
A分子杂交B.基因测序C.反义核酸技术D.变性高效液相色谱法E.PCR
13.下列哪种方法不是目前基因治疗所采用的方法（B）
A.自杀基因的应用B.基因矫正C.基因灭活D.基因增补E.基因疫苗
14.目前最常采用的基因治疗方法是（D）
A.自杀基因的应用B.基因缺失C.基因疫苗D.基因增补E自杀基因的应用
15.与基因灭活无关的是（E）
A.反义RNA技术B.核酶技术C.基因敲除D.RNA干扰技术E.自杀基因的应用
16.下列哪种方法属于非病毒介导基因转移的化学方法（E）
A.电穿孔B.基因枪技术C.DNA直接注射法D.逆转录病毒介导的基因转移
E.脂质体介导的基因转移
17.下列哪种载体是目前基因治疗最常用的载体（B）
A.HSV病毒载体B.逆转录病毒载体C.EB病毒载体D.脂质体载体E.YAC载体
18.目前下列哪种情况不能作为基因治疗的病种（C）
A.在DNA水平上明确的单基因缺陷疾病B.靶细胞可以从病人身上获取、培养，再回输给患者C.生殖细胞的基因治疗D.治疗效果胜过对病人的危害E.表达水平无需严格调控即可使疾病得以改善且无毒副作用
（三）.名词解释
1.基因诊断（genediagnosis）
答:
采用分子生物学技术来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否正常，以此来对相应的疾病进行诊断
2.基因治疗（genetherapy）：
通过一定方式将正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法，是以改变遗传物质为基础的生物医学治疗
5.基因矫正（genecorrection）：
纠正致病基因中异常碱基，保留正常部分。
6.基因置换（genereplacement）：
通过体内基因同源重组，用正常的基因原位替换病变细胞的致病基因，使其恢复正常状态
9.自杀基因（suicidegene）：
一类可以导致受体细胞死亡的外源基因。
该基因表达的产物（某些病毒或细菌产生的酶）能将对人体无毒或低毒的药物前体转变为细胞毒性物，从而导致细胞死亡
四.问答题
1.什么是基因诊断？
基因诊断的特点是什么？
答：
基因诊断室采用分子生物学技术来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否正常，以此来对相应的疾病进行诊断
基因诊断的特点有针对性强；特异性高；灵敏度高和适用面广。
2.什么是基因治疗？
简述基因治疗的基本程序及其要点。
当前基因治疗拟采用哪些方法？
答：
基因治疗是通过一定方式将正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法，是以改变遗传物质为基础的生物医学治疗
基因治疗的技术流程选择治疗性基因、选择基因载体、选择靶细胞、基因转移、筛检表达的外源基因和回输体内六个步骤。
基因治疗拟采用的方法有基因矫正和基因置换、基因增补、基因灭活、“自杀基因”的应用、“基因疫苗”的利用以及复杂疾病应采用综合治疗方案。
6.简述常用的基因灭活技术有哪些？
答：
（1）反义核酸技术
（2）.核酶技术；（3）.三链技术（4）.RNA干扰技术（5）.肽核酸技术和基因敲除技术等
7.法医学中如何进行个体识别和亲子鉴定？
答：
个体识别和亲子鉴定可选用VNTR、STR和SNP三种多态性遗传标志进行Southern印迹或PCR分析。
现今多采用VNTR或STR遗传标志进行PCR。
（1）个体识别根据遗传标志侧翼保守序列设计引物，用PCR对该区进行扩增。
因遗传标志长度不同，产物经琼脂糖凝胶电泳条带位置不同。
除同卵双生子外，不同个体具有不同的条带，具有高度特异性，可进行个体识别。
（2）亲子鉴定孩子的基因组一个来自母亲，一个来自父亲，故可通过对他们遗传标志进行PCR，判断亲缘关系。
第八章常用分子生物学技术
一选择题
（一）最佳选择题（每题有五个备选答案，只有一个是正确的，请选择正确答案）
1.下列哪项不是理想的核酸探针标记物应具备的特性（E）
A.检测方法灵敏度高且特异性强B.运用酶促方法标记时，对酶的活性无较大影响C.不影响探针分子的主要理化性质D.与核酸探针分子结合后不影响其碱基配对的特异性E.可大大降低杂交体的解链温度
2.切口平移法标记DNA探针时使用（B）
A.Klenow片段B.DNA聚合酶ⅠC.DNA聚合酶ⅡD.DNA聚合酶ⅢE.TaqDNA聚合酶
3.运用切口平移法标记核酸探针时，标记物应位于（C）
A.碱基的N原上B.脱氧核糖的3’-OH的氧原子上C.脱氧核苷三磷酸的α-磷酸位上D.脱氧核苷三磷酸的β-磷酸位上E.脱氧核苷三磷酸的γ-磷酸位上
4.随机引物标记法所采用的引物是（E）
A.6~8个核苷酸片段的混合物B.引物分子的每一个位置都可能出现4种碱基的任意一种C.引物可用与任意核苷酸序列互补结合D.A和C是正确的E.A、B、C三者均正确
5.随机引物标记探针，下列各项中那一项是不正确的（A）
A.双链DNA、单链DNA、RNA都是可以标记的B.不需要用DNaseⅠ预处理
C.反应时可用Klenow片段D.反应时可用DNA聚合酶ⅠE.反应时可以用逆转录酶
7.klenow片段与DNA聚合酶Ⅰ相比，前者丧失了哪一活性（C）
A.5’→3’合成酶B..3’→5’外切酶C..5’→3’外切酶D.转移酶E.连接酶
8下列哪一项不是Southern印迹法的步骤（B）
A.用限制酶消化DNAB.DNA与载体的连接C.用凝胶电泳分离DNA片段D.DNA片段转移至硝酸纤维素膜上E.用标记的探针与膜杂交
9.RNA电泳转移后与探针杂交叫作（B）
A.Southern印迹B.Northern印迹C.Western印迹D斑点杂交E.原位杂交
10.无需经历核酸的提取过程即能进行的杂交为（D）
A.斑点杂交B.Southern印迹C.Northern印迹D.原位杂交E.RPA
.16.下列关于PCR引物设计的说法错误的是（D）
A.设计引物时应考虑使3’端引物和5’端引物具有相似的Tm值
B.每条引物自身不应有稳定的发夹结构
C.上下游引物之间不宜形成稳定的二聚体结构
D.引物的5’和3’端必须和模版严格配对结合
E.引物与非特异扩增区的序列无同源性
17.PCR反应中，所设计引物的长度一般为（B）
A.5~10核苷酸B.15~30核苷酸C.〈50个核苷酸D.50~100核苷酸E.长度任意
18.TaqDNA聚合酶活性需要以下哪种离子（C）
A.K+B.NA+C.Mg2+D.Ca2+E.Cl-
19.以下哪种PCR技术广泛应用于组织胚胎学和肿瘤学的研究（A）
A.原位PCRB.多重PCRC.不对称PCRD.反向PCRE.巢式PCR
20.已知一段设计好的引物的序列为GTGGATCCATGGCTCCTCTGAAGATTC,其Tm值为（C）
A.78B.80C.82D.84E.无法计算
21.以下关于dNTP的说法错误的是（C）
A.dNTP不宜反复冻融，应小量分装保存B.dNTP具有较强的酸性，使用时应将PT调至7.0~7.5C.PCR反应中，四种dNTP必须按等质量浓度配置，以减少反应的错配率。
D.dNTP的浓度过高会增加碱基的错配率E.dNTP的浓度低，反应速度下降，但特异性提高
22.TaqDNA聚合酶可以不要模板在dsDNA的末端加上一个碱基为（C）
A.GB.CC.AD.TE.I
23.催化常规PCR的酶是（C）
A.RNA聚合酶B.DNA聚合酶C.TaqDNA聚合酶D.反转录酶E.Klenow酶
24.PCR产物具有特异性是因为（C）
A.TaqDNA酶保证了产物的特异性B.合适的变性、退火、延伸温度C.模板进行了钝化
25.关于PCR扩增停滞的原因有很多种，但下列各项中，那一项不是主要原因（A）
A.引物浓度过高B.dNTP的大量消耗C.产物的聚集D.非特异性产物的竞争性抑制E.DNA聚合酶活性逐步降低
26.下列有关基因芯片技术的描述错误的是（B）
A.基因芯片技术的工作原理与核酸分子杂交一致B.基因芯片技术均是应用已知核酸序列为探针与互补的靶核苷酸序列杂交C.基因芯片技术能够在同一时间内平行分析大量的基因D.基因芯片技术可发现大量的新基因E.利用基因芯片技术可研究药物作用的分子机理
27.关于基因芯片的制备描述错误的是（E）
A.寡核苷酸探针可在芯片上直接合成B.可将特定基因的PCR产物点在芯片上作为探针
C.芯片设计时应首要考虑探针的特异性D.探针的长度有一定的限制
E.一个靶基因应只设计一个探针以提高结果的可靠性
28.关于基因芯片杂交反应描述错误的是（E）
A.靶基因在与芯片杂交前需进行标记B.杂交反应的条件根据探针的长度、类型及芯片的应用来选择并优化C.杂交信号的强弱与样品中靶基因的量呈正相关D.芯片杂交属于固—液相杂交E.表达检测的杂交时间应比突变检测的杂交时间短，所需的温度低
29.应用基因芯片研究基因的差异表达时，靶基因应如何进行标记（B）
A.人、提取RNA，进行PCR反应时标记B.提取RNA，进行逆转录反应时标记
C.提取RNA，用化学标记法进行标记D.提取DNA，进行体外转录反应时标记
E.提取DNA，进行PCR反应时标记
30.应用基因芯片技术进行杂交测序，一靶基因与含有65536个八核苷酸探针的阵列杂交后，有7个探针发出最强荧光信号，则该靶基因最可能的长度为（C）
A.12bpB.13bpC.14bpD.15bpE.16bp
33.铁壁细胞基因转染的首选方法是（C）
A.DEAE—葡聚糖介导转染法B.脂质体介导转染法C.磷酸钙介导转染法D.细胞显微注射法E.电击基因转染法
34.下列关于病毒基因转染的描述错误的是（C）
A.病毒转染所用的载体主要是逆转录病毒B.转入的基因在受染细胞内可生成双链DNA
C.逆转录病毒是DNA病毒D.目的基因可整合到细胞基因组DNA中E.目的基因可在受体细胞内永久表达
（三）多项选择题
1.下列关于切口平移标记和随机引物标记的叙述正确的有（ABD）
A.两者均是全程标记的方法B.两种方法所标记的探针长度均可调节
C.标记所得产物变性后两条链都可以作为探针D.标记过程均需要模板
E.均利用了大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’合成酶活性和5’→3’外切酶活性
2.液相杂交与固相杂交相比较，区别有（CDE）
A.无需进行核酸的提取B.杂交后不需要处理即可进行杂交信号检测C.靶分子不用钝化D.无需进行核酸片段的转移和固定E.探针与靶序列直接在溶液里进行反应
3.下列哪些杂交技术科用于检测RNA（BCDE）
A.Southern印迹B.Northern印迹C.RPAD.S1作图E.原位杂交
5.下列关于退火温度说法正确的是（AC）
A.合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右B.在Tm允许的范围内，提高退火温度可以增加产量C在Tm允许的范围内，选择偏高的退火温度可以提高PCR反应的特异性D.退火时间至少需要1minE.退火时间越长特异性越高
6.进行PCR试验时以下措施有助于防止污染和结果的假阳性（ABCDE）
A.反应体系在超净台配置B.隔离不同的操作区C.分装试剂，减少重复取样所致的污染
D.实验者应戴口罩及手套E.设立试验对照
7.PCR的产物积累的特征是（AC）
A.扩增阶段，目的DNA片段呈指数增加B.扩增阶段，目的DNA片段呈线性增加
C.反应后期基本上不可避免的进入平台期D.到达平台期的PCR循环数取决于反应体系中酶的耗竭程度E.到达平台期时若扩增目的DNA片段不足，可继续加入模板，酶和缓冲液进行PCR反应
8.PCR延伸温度应有如下特点（ACD）
A.一般为72℃B.延伸时间越短，产物的得率越高C.TaqDNA酶在延伸温度时有较高的酶活性D.延伸时间根据待扩增片断的长度而定E.延伸时间越长，产物的特异性越高
9.PCR反应出现非特异产物时，应该采取的措施是（ABCDE）
A.提高退火温度B.降低TaqDNA酶浓度C.减少退火及延伸时间D.减少引物浓度E.减少扩增循环次数
10.PCR可以广泛应用于（ABCDE）
A.遗传性疾病的基因诊断B.检测癌基因C.检测病原微生物D.法医鉴定E.DNA序列测定
12.基因芯片可进行哪些与药物相关的研究（ABCDE）
A.从基因水平分析药物作用的机理B.新药开发C.发现药物作用的靶点D.中草药的鉴定E.药物毒性的评价
13.非病毒类基因转染的描述正确的有（ACE）
A.非病毒类载体无传染性、容易大量制备B.转入的目的基因易于与细胞染色体整合C.转入的目的基因在细胞质中呈现暂时性的表达D.该转染方式能观察到目的基因在转入个体内的整体表达情况E.脂质体介导转染属于非病毒类转染
14.病毒作为转基因动物的基因转移载体有以下哪些优点（ACD）
A.转移率较高B.目的基因都可以与细胞染色体整合C.目的基因能在细胞中稳定表达D.目的基因可通过遗传传递给子代E.有的病毒载体具有致癌性
二.填空题
1.PCR的基本反应过程包括：
变性退火延伸三个阶段。
2.PCR的反应体系包括：
模板DNATaqDNA聚合酶引物缓冲液dNTP
3.原位杂交使用核酸探针检测细胞和组织中特定核苷酸序列的位置。
4.切口平移法标记DNA的基本原理在于利用DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’外切酶和5’→3合成酶的作用。
6.基本芯片的制备方法主要有点样法和原位合成法。
7基因芯片的主要技术流程包括芯片的设计与制备靶基因的标记芯片杂交杂交信号检测
8.基因克隆的策略可分为表型克隆定位克隆定位候选克隆
9.转基因技术的三个关键环节为转移基因的选择转入基因的导入转移基因的整合和表达
10.常用于基因敲除的靶细胞是小鼠ES细胞
三.名词解释
1.核酸探针（nucleicacidprobe）：
用放射性核素生物素或其他活性物质标记的一段序列已知的核酸片段，能与靶序列互补而检测出核酸样品中的特定基因。
2.核酸分子杂交技术（nucleicacidhybridizationtechniques）:
即核酸分子杂交技术，指两条来源不同但有互补关系的DNA单链，或DNA单链与RNA分子，在去掉变性条件后互补的区段能够退火形成双链DNA分子或DNA／RNA异质双链的过程称为分子杂交。
3.聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）:
以拟扩增的DNA为模板，以一对分别与DNA分子两条链的3’端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的催化下，按照半保留复制的机制合成新的DNA，重复这一过程，即可使目的片段得到扩增。
5.原位PCR（nestedPCR）:
先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为模板扩增获取目的基因，可以提高PCR的效率和特异性。
四．问答题
3.试述PCR的基本原理及引物设计原则？
答：
（1）PCR的原理是根据待测DNA片段两端的核苷酸序列，设计并人工合成两个分别与DNA片段两端互补的寡聚核苷酸引物，在有过量的引物、过量的底物、DNA聚合酶以及模板的反应体系中，经过高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段的循环周期使模板DNA以几何级扩增。
（2）引物设计一般遵循下列原则
①引物长度一般为15~30个核苷酸
②碱基随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。
③3’端和5’端引物具有相似的Tm值。
④避免发夹结构形成，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过4bp。
⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。
⑥引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。
⑦引物3’端碱基一定要与模板DNA配对。
⑧引物的5’端可以修饰。
如加限制酶位点，引入突变位点等。
4.试述PCR反应条件的优化？
答：
（1）引物引物设计及合成质量的好坏至关重要，合成的引物常用聚丙稀酰胺凝胶电泳或反向层析柱进行钝化。
冻干的引物可于—20℃下保存6个月。
在一个标准的PCR反应中，引物的终浓度为0.2~1mmol／L。
（2）缓冲液目前常用的PCR缓冲体系为pH8.3~8.8（20℃）的10~50mmol／LTris-HCl.
（3）Mg2+Mg2+离子浓度影响TaqDNAJ聚合酶的活性和忠实性，还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等。
Mg2+浓度为200μmol／L时，Mg2+浓度为1.5mmol／L较合适。
（4）dNTPTaqDNA聚合酶缺乏3’→5’端的外切活性，没有校错功能，会产生碱基的错误渗入。
所用的四种dNTP的终浓度应该相等，以使错掺率降到最低。
（5）耐热DNA聚合酶耐热TaqDNA聚合酶的引入是PCR实验成败及走向实用化的关键。
除了耐热TaqDNA聚合酶外，还开发了其他耐热酶，如Pfu、Vent和Tth等，并且还用基因工程的方法生产了一些重组的耐热酶。
（6）温度循环参数
退火温度—退火温度的优化首先采用计算引物—模板对的Tm值。
但其中一个单一碱基的错配大约降低Tm值5℃。
所以应将Tm值看为估计值。
变性温度——典型的变性条件是95℃、30s，或97℃、15s。
对于富含G+C的靶序列，温度高可能更有效，但是也会影响酶活性。
最好采用薄壁的试管。
延伸温度——作为一般的规律，TaqDNA聚合酶1min延伸1kb的长度。
（7）循环数循环数决定着扩增程度，在其他参数都已优化的条件下，最适循环数取决于模板的初始浓度。
在初始靶序列为3×105、5×104、1×103、50个拷贝分子时，其循环数可分别为25~30、30~35、35~40、40~45个循环。
（8）PCR促进剂二甲基亚砜（DMSO）有变性DNA模板的作用，对Klenow片段有利，但对TaqDNA聚合酶有抑制作用，尽量不用。
甘油有助于PCR反应的复性过程，优对G+C含量高和二级结构多的模板以及扩增长片段（〉1500kb）更适用，但并非对所有的PCR均有益。
氯化四甲基胺（TMAC）可以去除非特异性扩增，促进PCR但又不抑制TaqDNA聚合酶。
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