染色体显带原理与技术ppt课件.ppt

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.,染色体显带原理与技术,肖文珺首都医科大学附属世纪坛医院检验科细胞分子遗传专业组,.,一、染色体制备基础知识,

（一）细胞及细胞周期

（二）从DNA到染色体,.,

（一）细胞周期及有丝分裂,细胞：

生物体结构和功能的基本单位，也是生命活动的基本单位。

图略。

细胞周期：

指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程。

G1期，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；S期，指DNA复制的时期；G2期，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；M期，细胞分裂开始到结束。

G0期：

间期细胞，细胞周期之外的细胞。

.,有丝分裂,.,

（二）从DNA到染色体,DNA,螺线管,超螺线管,染色单体,核小体,压缩7倍,压缩40倍,压缩6倍,压缩5倍,共计压缩8400倍,.,核小体nucleosome：

染色质的基本结构,.,DNA分子的不同存在形式：

染色质和染色体,染色质：

间期细胞核中遗传物质的存在形式。

染色体：

分裂中期遗传物质的存在形式。

一条染色体是一个DNA分子。

.,染色质：

根据在分裂期和间期的染色不同，分为,常染色质：

在间期核中分布较稀疏，浅染色，是转录活跃的DNA部分，一般位于核中央。

在分裂期，位于染色体臂，深染色。

含大量功能基因。

异染色质：

是呈凝集状态的DNA与组蛋白的复合物，由于螺旋化程度高，又称为浓缩染色质，一般位于核内膜的边缘形成一薄圈，即称周围染色质。

主要位于位于染色体的着丝粒、次缢痕、端粒等位置。

间期和分裂期都深染色。

基本无功能基因。

.,基本概念,在细胞周期的有丝分裂中期，染色体的形态结构比较稳定，一般所描述的染色体的形态结构都是中期染色体。

染色体组型：

又称核型Karyotype，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。

核型模式图Idiogram：

是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。

.,二、染色体显带技术,.,Q带：

喹丫因染色后，紫外照射下的明暗带（富含AT的明带，富含GC的暗带）；G带：

Giemsa染料染色后所呈现的染色体区带；（AT区是深色）R带：

是中期染色体经碱性磷酸盐处理，丫啶橙或Giemsa染色后所呈现的带型，一般与G带正好相反；C带：

显示着丝粒结构异染色质及其它染色体区段的异染色质。

T带：

是染色体端粒部位经丫啶橙染色后呈现的区带；N带：

Ag-As染色，主要染核仁组织者区域的酸性蛋白。

1975年建立了染色体高分辨显带技术。

.,几种显带的制作方法之间的关系,.,G显带实验原理基础G显带：

制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹带，表明每条染色体的特征。

只有可以分裂的活细胞，才能制备染色体。

实验材料：

人外周血淋巴细胞，植物血凝素（PHA）刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。

使用秋水仙素或者秋水仙碱破坏纺锤丝的形成，将细胞阻留在有丝分裂中期。

从而获得大量的细胞中期分裂相供染色体分析。

-采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞。

细胞低渗技术使细胞中的染色体在玻片上铺散得更好，易于计数和观察。

甲醇/冰醋酸固定液快速杀死和固定细胞。

.,染色体检查过程（G显带）,培养细胞；秋水仙素处理；抑制中期分裂相低渗；使细胞膨胀固定；染色体形态固定滴片；分散染色体。

冰片法，熏蒸法。

显带和染色；显微镜下分析。

.,实验步骤1.采血及接种培养1.1采血：

灭菌注射器抽取外周静脉血35ml（绿帽肝素抗凝管）1.2接种在超净工作台中，注射器滴加25滴全血（6号针头）至外周血淋巴细胞培养液中（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清），水平摇动混匀。

置37恒温培养箱中培养6872小时。

1.3终止培养前3540min，加入秋水仙素，使终浓度达到0.5g/ml。

轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。

继续培养。

秋水仙素主要作用在于能阻滞微管（纺锤丝）形成，或使已形成的微管解聚，从而使染色体停留在中期。

秋水仙素浓度大，则处理时间短，如浓度小，则处理时间长。

但若秋水仙素加入过量，或处理时间过长，分裂细胞多，染色体凝集和收缩变小，或发生异常分裂现象，甚至染色体破碎，不宜用于观察染色体的形态及计数；秋水仙素加入太少，或处理时间偏短，染色体形态偏长或无中期分裂相。

.,2制片2.1收集细胞：

将全部培养物吸入刻度离心管中，2000rpm离心5分钟2.2低渗：

弃上清液，加入37预温的0.075mol/LKCl溶液8ml，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37恒温水浴箱低渗处理2025分钟。

2.3预固定：

加入1ml新配制的固定剂（甲醇：

冰乙酸=3：

1）或清质剂300ul，用吸管小心吹打、混匀，2000rpm离心5分钟。

2.5固定：

第一次：

弃上清液，加入3ml固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定15分钟，2000rpm离心5分钟。

第二次：

弃上清液，重复固定一次。

第三次：

弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。

2.6滴片：

吸取少量细胞悬液，滴23滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，水蒸气熏蒸，702小时烤片，待染色。

.,3.G显带3.1取2.5胰酶溶液0.5ml，加入50ml生理盐水染色缸中（终浓度0.025%），用1NHCl或1NNaOH调节PH7.0左右，置37OC预温。

3.2将烤好的玻片标本放入胰酶溶液中处理60秒钟左右（胰酶消化时间需不断调试，摸索。

不同时间配制，不同批号胰酶，以及随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间都会变化）3.3取出染色体玻片标本，置于37预温的生理盐水中，终止胰酶的作用。

3.4将玻片标本放入37预温的1：

10稀释的Giemsa染液中，染色510分钟。

3.5自来水冲洗，自然晾干。

.,.,G显带常见问题及处理：

培养细胞:

细菌污染。

霉菌污染。

细胞收获量小。

玻片上细胞间期核稀疏。

秋水仙素：

大量染色体太细长，缠成毛线团样。

分裂相很多，但染色体短小，分叉。

几乎没有分裂相。

低渗：

太分散。

不分散。

固定：

太发毛。

背景不干净。

有大团块深染色物质。

滴片；不分散。

太分散。

显带和染色；没有条带。

条带模糊。

一个分裂相内，有的染色体有条带，有的没有。

有的胰蛋白酶消化太过，有的分裂相则不足。

Giemsa染不上色。

染色太深。

染色太浅。

.,各种组织标本的染色体制作,不同的标本，不同的检查目的，需要调整染色体的制作过程。

处理原则：

使尽可能多的细胞进入细胞周期，旺盛生长，大量分裂，防止污染。

.,外周血：

5%小牛血清RPMI-1640，+PHA。

检查体细胞核型。

骨髓：

10%小牛血清RPMI-1640，不含PHA。

检查肿瘤细胞核型。

羊水：

标本珍贵。

专用羊水培养基，防止母体细胞污染。

检查胎儿细胞核型。

绒毛组织：

同上。

细胞为细胞团（组织），防止细菌污染。

清洗、剪碎后消化成单细胞或者细胞团培养。

检查胎儿核型。

脐带血：

血液细胞，性质同外周血。

一定注意防止母体污染！

检查胎儿核型。

活检组织：

如实体瘤标本。

细胞系：

永生细胞。

直接常规制作染色体标本即可。

.,C显带,将染色体用碱或者去垢剂处理后，再用Giemsa染色，可以得到只显示着丝粒区域的带纹，称为C带。

.,实验原理,C显带技术由Arrighi和Hsu于1971年发明，是显带技术中最简单的一种带型。

其方法的本身是起源于原位杂交。

Arrighi和Hsu发现用碱处理载玻片上的染色体使DNA变性之后，再在SSC溶液中、65的条件下使其复性，在受控制的条件下经Giemsa染色可显示出在染色体的一定部位是深染的。

70年代用原位杂交的方法证明深染的区域（C带区）是结构异染色质的区域，也就是一般而言的DNA高度重复序列的区域。

然而，现在更为流行的看法认为氢氧化钡或其它碱性物质的处理是优先提取了非C带区的DNA，SSC的处理有助于带型的清晰。

.,实验用品,光学显微镜，恒温水浴箱，培养皿，小镊子，未染色的染色体标本片（片龄一周内），5%氢氧化钡水溶液，2SSC液，0.2mol/LHCl，PBS，吉姆萨染液。

.,实验方法,1、制片：

常规外周血法制备的标本。

2、HCl处理：

取5-7天标本龄的染色体标本，选择染色体分散好的标本在0.2mol/LHCl中室温下处理10分钟-1小时，然后用自来（蒸馏）水冲洗干净。

这一处理是使DNA脱嘌呤，但没有DNA骨架的断裂。

（此步也可省略）3、氢氧化钡处理：

将标本浸入60-65的5%（饱和）氢氧化钡液中，10秒至几分钟（随标本龄而变动，常规：

1-4分钟；1月龄片：

8-16分钟，最好设置梯度），碱性处理可能通过产生一个高水平的DNA变性，促进DNA溶解。

.,4、2SSC处理：

在60-65的2SSC液中处理90分钟时，用自来水冲洗干净，2SSC温育可使DNA骨架断裂并使断片溶解。

5、染色：

用蒸馏水配制5%Giemsa，染色5-10分钟，用自来水冲洗干净，室温下风干后即可镜检。

6、镜检：

用显微镜高倍镜镜下检查显带标本，如着丝粒区域或异染色质部位（1,9,16号染色体次缢痕）及Y染色体长臂q12深染，染色体其它部位染色浅，即为可取标本。

若观察到染色体均呈白色，那么，可能是碱处理或2SSC温育过度。

.,显带观察,严格地讲，C带显示的是紧邻着丝粒的异染色质区。

可见，在人体染色体C带标本中，深染的有：

1、绝大多数染色体的着丝粒区；2、第1，9和16号染色体的次缢痕；3、Y染色体长臂的远侧端。

.,巴黎会议（1971）对各条染色体的C带描述如下:

1号大，从着丝粒扩展到q。

2号小。

3-8号中等9号大，从着丝粒扩展到q。

10号中等。

11号中等，但比10号或12号大些。

12号中等。

13号中等，有时分为二节。

14号-15号中等。

16号大，从着丝粒向q扩展。

.,17号中等。

18号中等，但比17号大些。

19-22号中等。

X中等Y在着丝粒处有一条非常窄的带；q的末端有一宽带。

1，9，16号的C带和Yq上的宽阔的远侧带都有明显的形态变异及异态性。

.,.,.,R显带,原理：

在细胞的培养过程中加入碱基的类似物，然后用紫外线照射后再用Giemsa染料染色，可以得到和G显带相反的带纹，称为R带。

即G显带的深带变为浅带，浅带染成深带。

当G显带显示的染色体两臂末端为浅带时，如果两臂末端发生缺失等异常，一般难以发现和识别，而R带正好能将此处显示出易于识别的深带。

所以，R显带技术有利于检测染色体的末端缺失、重排等。

.,光学显微镜、恒温水浴箱、紫外灯、培养皿、常规制片材料、BrdU、秋水仙素、2SSC溶液（0.3mol/LNaCl+0.03mol/L柠檬酸钠）、Gimesa染液等。

实验用品,.,实验方法,1.常规培养细胞，终止前10小时在培养基中加BrdU（使其终浓度为12g/ml）。

2.继续培养6小时后加秋水仙素20g/ml的3滴（7号针头垂直竖滴，使终浓度为0.04-0.08g/ml）。

3.常规收获、处理细胞，制片。

4.在60恒温水浴箱中，置一培养皿于水面上（皿内加1/32SSC溶液，将所制玻片浸泡在内）。

距玻片10cm处放置一20瓦紫外灯，照射玻片30-45分钟。

5.待紫外处理时间结束后，用自来水冲净。

6.Gimesa染色5分钟，自来水冲净，室温干燥后于镜下观察。

.,注意：

1.Brdu的浓度和作用时间是实验成败的关键。

2.紫外灯照射距离玻片太远也不利于带型的显示。

3.若为女性标本，还可见淡染的迟复制X。

.,显带观察,各号染色体显现的带纹与G显带相反，在G带染色体标本出现的深带用R显带法就是浅带，同时在G显带染色体标本出现的浅带用R显带法就是深带。

与G显带的对比图：

.,R显带总体图,.,.,G11技术,G11式显带是一种特异性显示9号染色体次缢痕的显带方法，一般用于9号染色体次缢痕多态分析、家系调查，亲子鉴定等研究以及9号染色体倒位的细胞遗传学分析。

.,实验用品,光学显微