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分子生物学检验技术教学大纲

一、前言

分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据。

它是一门迅速发展、有广阔应用前景、并逐渐走向独立的学科。

分子诊断学的研究范畴包括：

利用遗传学、病理学、免疫学、生物化学、基因组学、蛋白质组学和分子生物学的理论和方法，探讨疾病发生和发展的分子机制；为整个疾病过程寻求特异的分子诊断指标；以及利用分子生物学技术为这些分子诊断指标建立临床实用的检测方法。

从生物中心法则来看，利用分子诊断技术可以判断疾病基因易感性、结构异常或基因表达异常。

检测基因的存在和基因结构异常主要通过测定DNA/RNA来实现；而检测基因表达的异常，在转录水平主要是检测mRNA的表达的质和量，在翻译水平则以检测蛋白质的质和量来反映核酸表达水平的变化。

本课程总学时30学时，理论30学时

二、教学内容及基本要求

第一章原核生物基因组和病毒基因组

[目的要求]

掌握基因的分子生物学定义；限制性片段长度多态性的概念；质粒的定义和用途；操纵子的结构

熟悉病毒基因组和细菌基因组的特点。

原核细胞内核酸含量、种类、功能和组织结构的差异；

了解转座因子大肠杆菌、HIV和HBV基因组特点

[教学时数]

2学时

[讲授内容]

基因的概念基因的生物学定义、基因的分子生物学定义、细胞基因组。

原核生物和真核生物生物种类、原核细胞和真核细胞内核酸含量、种

类、功能的差异，操纵子结构。

病毒基因组：

重叠基因HBV和HIV等病毒的结构特点

细菌基因纽细菌染色体基因组的结构特点；大肠杆菌、质粒。

[复习思考题]

名词解释

基因、质粒、断裂基因、假基因、限制性片段长度多态性、操纵子

问答题

1·简述原核细胞基因组特点。

第二章真核生物基因组

[目的要求]

掌握:

：

真核生物基因组的特点；单拷贝序列、中度重复序列和高度重复序列的概念。

熟悉：

染色质的结构和主要成分、核小体是染色质的基本结构单位。

了解：

染色体形态、功能研究中所用术语与新技术简介、朊病毒。

[教学时数]

2学时

[讲授内容]真核生物学特点一般特点、C值矛盾、真核生物DNA序列的类型（单拷贝序列、中度重复序列、高度重复序列、人多基因家族、DNA指纹技术（限制性片段长度多态性）。

染色体的主要成分、染色体的分型、染色体疾病

[复习思考题]

名词解释

单顺反子、外显子、内含子、C值矛盾、单拷贝序列、中度重复序列、高度重复序列

问答题

真核生物基因组的特点。

第三章蛋白质组和蛋白质组学

[目的要求]

掌握蛋白质组概念；二维电泳

熟悉蛋白质组的研究范畴；研究蛋白质组的基本方法（如酵母双杂交、凝胶滞后电泳等）

了解蛋白质的数据库；蛋白质的医学应用

[教学时数]

3学时

[讲授内容]

蛋白质组的概念和特点

蛋白质组的研究范畴

蛋白质和蛋白质的相互作用的研究方法（酵母双杂交、噬菌体展示、生物传感芯片质谱、蛋白质定点诱变）

蛋白质和核酸相互作用的研究方法（凝胶滞后试验、滤膜结合法、甲基化干扰实验、DnaseI足纹分析等）

蛋白质质点的分离和鉴定（二维电泳、质谱技术等）

蛋白质的结构分析

蛋白质的数据库

[复习思考题]

概念

蛋白质组、凝胶滞后实验

简答题

1.蛋白质和核酸相互作用的研究方法有哪些？

2.二维电泳的基本原理是什么？

3.酵母双杂交系统的原理

第四章癌基因和抑瘤基因

[目的要求]

掌握癌基因和抑癌基因的概念；癌基因激活的机制

熟悉sis家族、src家族、myc和myb家族、P53、RB家族及其表达产物；癌基因和抑癌基因的检测

了解肿瘤发生的步骤；结肠癌的发病步骤

[教学时数]

2学时

[讲授内容]

肿瘤细胞的特征

肿瘤病毒和癌基因DNA肿瘤病毒和癌基因；反转录病毒和癌基因。

肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因存在的证据；RB基因，p53基因。

肿瘤形成的多步骤学说多步骤学说的实验证据；人类直肠癌和多步骤致癌论。

[复习思考题]

名词解释

癌基因、肿瘤抑制基因、反转录病毒

问答题

l简述RB基因和p53的功能。

2.原癌基因的激活的机制

第五章核酸的分离和纯化

[目的要求]

掌握基因组DNA的分离方法和原理；质粒DNA分离方法和原理；核酸的浓度和纯度鉴定

熟悉核酸分离的基本原则；RNA抽提；mRNA的分离和纯化

了解CsCl-EB法的原理核酸的回收和保存

[教学时数]

3学时

[讲授内容]

核酸抽提的原则

核酸的分离、纯化、浓缩、洗涤

核酸的保存、浓度和纯度鉴定（紫外分光光度法、荧光光度法）

基因组DNA分离的原理，各试剂的主要用途

DNA的回收（DEAE纤维素膜插片电泳法；电泳洗脱法；低熔点琼脂糖凝胶回收法）

质粒DNA的提取和纯化（碱裂解法、煮沸法）

质粒DNA的纯化和回收

RNA的抽提和mRNA的分离

[复习思考题]

问答题

1.酚-氯仿法抽提基因组DNA的原理

2.质粒制备的主要方法是什么？

并阐明其基本原理

3.如何鉴定核酸的浓度和纯度

第六章DNA重组技术

[目的要求]

掌握基因重组的主要工具酶和它们的作用；DNA重组的主要载体和它们各自的优点；目的基因的概念及用途；构建cDNA文库的原理与基本操作流程；载体的概念及特征；载体的筛选标志和筛选方法；转化、转染、转导的概念、感受态菌的概念、重组子的鉴定方法；

熟悉克隆和DNA重组的概念、基因重组的基本步骤；获得目的基因的4种基本方法；常用的质粒载体；连接反应的建立；CaCl2法进行重组子的转化；

了解基因重组的发展历史；重组DNA技术意义；基因序列分析的双脱氧链终止法的测序原理；λ噬菌体的分子生物学；

[教学时敷]

6学时

[讲授内容]

分子生物学简史、DNA重组技术构建和大肠杆菌转化体系的建立；

重组DNA技术的定义及步骤重组DNA技术定义

重组DNA技术基本步骤

重要的工具酶限制性核酸内切酶（命名、分类、11型限制酶的功能、应用及注意事项况）；DNA聚合酶（大肠杆菌DN人聚合酶I及其大片段、TagDNA聚合酶、反转录酶）。

DNA连接酶；T4多核苷酸激酶；碱性磷酸酶。

主要的载体：

质粒载体（pBR322、pUC等）、噬菌体载体、SV40载体、穿梭载体、反转录病毒载体、人工染色体。

获得目的基因的原理方法构建cDNA文库、筛选目的基因（真核mRNA的分离纯化、反转录合成cDNA、构建cDNA文库、筛选目的基因）；构建真核细胞基因组文库筛选目的基因（分离纯化基因组DNA、DNA片段与载体的连接包装、导入细胞、筛选目的基因）；人工合成目的基因DNA片段、聚合酶链反应合成DNA；其他方法。

获得目的基因方法的选择序列目的、特点、设备条件

目的基因序列测定测定的意义、目的基因测序方法（双脱氧链终止法、化学裂解法、自动测序仪法）；长链DNA测序的策略（随机法、嵌套缺夫法、引物延伸法）

基因克隆的载体质粒载体（概念、要求和种类）；常用的质粒载体及应用；噬菌体载体

目的基因与载体的连接连接的策略、连接反应的建立

重组子导入受体、氯化钙、电穿孔法

重组子的筛选与鉴定插入片段长度鉴定、插入片段方法鉴定。

[复习思考题]

名词解释

克隆、基因重组、限制性内切酶、星号活力、异源同工酶、DNA连接酶、切口、缺口、基因组文库、cDNA文库、差示文库、载体、定向克隆、多克隆位点、T-A克隆、转化、转染、转导、感受态、

问答题

1.基因重组中主要的工具酶有哪些？

它们的基本作用是什么？

2.什么是限制性内切酶？

有几种限制性内切酶？

基因工程中常使用的是哪一种？

为什么？

3.基因工程主要的技术路线

4.简述获得目的基因的4种基本方法及特点。

5.简述构建真核细胞基因纽文库筛选目的基因的方法。

6.试对各种获得目的基因的方法及其应用比较。

7．如何对重组子进行筛选与鉴定?

8．简述目的基因如何与载体进行连接?

第七章克隆基因表达及基因干扰

[目的要求]

掌握启动子、SD序列、增强子、终止子、p因子的概念和作用；融合蛋白的概念以及表达融合蛋白的优点，真核细胞表达元件，哺乳动物基因转移的遗传选择性标记。

熟悉Lac、Tac等元件的概念与作用；常见表达载体的特点，Western印迹杂交原理。

了解原核和真核生物表达的区别；表达产物的分离与纯化。

[教学时数]

3学时

[讲授内容]

基因表达概述、基因表达的概念、基本条件。

重组体在原核细胞中的表达原核生物基因表达的特点，外源基因在原核细胞中表达的重要调控元件。

原核细胞表达载体简介；对外源目的基因的要求。

重组体在真核细胞中表达的策略哺乳动物细胞表达的优点及载体种类、真核细胞表达元件，哺乳动物基因转移的遗传选择性标记、表位标记、western印迹杂交原理。

DNA序列测定鉴定

[复习思考题]

名词解释

非融合型表达蛋白、融合表达蛋白、包涵体、SD序列

问答题

1.真核表达体系和原核表达体系的主要区别

2.双脱氧末端终止法测序的原理

第八章核酸分子杂交技术与应用

[目的要求]

掌握杂交的原理和基本过程；原位杂交、探针、融解温度的概念

熟悉影响杂交速率和杂交稳定性的因素；探针的标记方法

了解预杂交和杂交介质；杂交的临床应用

[教学时数]

2学时

[讲授内容]

杂交概念、杂交的原理、融解温度、分子杂交

核酸探针的分类、探针标记的方法（全程标记和末端标记）

影响杂交反应的因素、杂交速率和杂交稳定性的要素

杂交各种介质的优缺点、预杂交的作用和成分、杂交的主要过程

杂交信号检测的方法

固相杂交（Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落杂交等）

[复习思考题]

名词解释

分子杂交、探针、原位杂交、融解温度、Southern杂交

问答题

1.分子杂交的探针的种类和特点

2.影响杂交速率和杂交稳定性的因素有哪些？

第九章聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用

[目的要求]

掌握PCR反应的概念和原理；PCR反应体系的组成成分；逆转录PCR原理和方法；限制性片段长度多态性；单链构象多态性

熟悉PCR相关技术、荧光定量PCR、变性梯度凝胶电泳

了解PCR技术在临床医学中的应用

[教学时数]

3学时

[讲授内容]

PCR的概念PCR的原理（变性、退火、延伸）

PCR反应体系的组成成分（模板、缓冲液、dNTP、TaqE、引物等）和主要作用

PCR技术的实验室质量控制

PCR技术的相关技术（逆转录PCR、原位PCR、定量PCR、多重PCR、免疫PCR、差异显示PCR、PCR定点突变等）

PCR产物的检测（RFLP、ASO、SSCP、DGGE等）

PCR在分子诊断中的应用（病原体检测、单基因遗传病、多基因遗传病、肿瘤、法医学等）

[复习思考题]

名词解释

PCR、RT-PCR、RFLP、SSCP

问答题

1.PCR的基本原理是什么？

PCR反应体系中基本的反应成分有哪些？

2.PCR产物的检测方法有哪些？

第十章生物芯片技术与应用

[目的要求]

掌握生物芯片的概念、生物芯片的分类；

熟悉生物芯片的应用价值；生物芯片检测的基本过程

了解芯片和探针的制备方法

[教学时数]

2学时

[讲授内容]

生物芯片、生物芯片的分类

生物芯片的制备和检测

生物芯片的医学应用

[复习思考题]

名词解释

生物芯片

问答题

1.简述生物芯片的医学应用价值

2.简述如何利用生物芯片检测单核苷酸多态性（SNP）

第十一章分子生物学检验技术的临床应用

[目的要求]

掌握基因诊断的原理和诊断途径；基因治疗的基本概念、策略和三个

基本条件。

熟悉基因诊断的方法及其应用；目的基因获得的方法、靶细胞选择

了解基因诊断在无感染性疾病、遗传病和恶性肿瘤中的应用。

反转录病毒载体的特点。

[教学时数]

2学时

[讲授内容]

基因诊断的定义原理

基因诊断的途径基因突变的检测方法（限制性内切酶谱分析、等位基因特异性寡核芋酸探针杂交法）；基因连锁分析的概念；mRNA的检测。

基因诊断的技术与方法核酸分子杂交和PCR技术

[复习思考题]

名词解释

基因诊断、基因治疗

问答题

1.基因诊断的原理和诊断途径

2.如何获得目的基因

3.如何选择载体和靶细胞