第八章遗传重组.docx
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第八章遗传重组
第八章 遗传重组（4h）
教学目的：
掌握重组的类型；明确位点专一性重组、异常重组的过程，了解重组的分子机理。
教学重点：
位点专一性重组、异常重组的过程。
教学难点：
重组的分子机理。
第一节遗传重组的类型
一、普遍性重组/同源重组
二、位点专一性重组
三、异常重组
第二节细菌的同源重组
一、细菌同源重组的特点
二、细菌转化重组机制
三、细菌的接合与转导中的重组机制
第三节位点专一性重组
一、噬菌体的溶菌周期和溶源周期
二、噬菌体的整合和切除
三、位点专一性重组的核苷酸序列
第四节同源重组的分子机制
一、异源DNA双链的断裂与重接
二、同源重组的Holliday模型
三、基因转变及其分子机制
第五节异常重组
一、原核生物中的转座因子（transposableelements）
二、真核生物的转座子
第六节转座的机制和遗传学效应
一、转座机制
二、转座子的遗传学效应
第八章遗传重组（4h）
第一节遗传重组的类型
一、普遍性重组/同源重组
其发生是依赖于大范围的DNA同源序列的联会，重组过程中，两个染色体或DNA分子相互交换对等的部分（如真核生物的非姊妹染色单体的交换）。
重组的普遍性和意义：
生物适应和进化的基础是遗传的变异，而变异的来源是突变和重组。
但突变的频率很低，且基因的突变有的有利，有的有害。
故变异的主要来源是基因间重组，结果产生各种不同类型的基因型个体。
早在1905年由W.Bateson和R.C.Punnett研究香豌豆两对性状遗传实验中就发现连锁基因之间重组。
1911年Morgan在果蝇有关性状遗传中对此做出科学的解释。
后来发现基因重组是所有生物遗传的基本现象，无论是高等生物还是细菌、病毒中都存在基因重组；不只是在减数分裂中发生基因重组，在高等植物的体细胞中也发生重组；重组不只是在核基因之间发生，叶绿体基因、线粒体基因间也发生基因重组，可以说只要有DNA就会发生重组。
二、位点专一性重组
这种重组是依赖小范围同源序列的联会，重组也只是限于小范围内，而且两个DNA分子并不交换对等的部分，有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中，因此将这种形式的重组又称为整合式重组（如噬菌体DNA通过其attP位点和大肠杆菌DNA的attB位点之间的专一性重组而实现整合过程。
又称为保守性重组。
三、异常重组
这种重组是发生在顺序不相同的DNA分子间，但在形成重组分子时往往是依赖于DNA复制而完成重组过程，因此又称为复制性重组（如转座因子从染色体的一个区段转移到另一个区段或从一条染色体转移到另一条染色体，这种转座作用既不依赖于转座因子DNA序列与插入区段DNA序列之间的同源性，又不需要RecA蛋白参与作用，只依赖于转座区域DNA复制和转座有关的酶而完成重组）。
第二节细菌的同源重组
一、细菌同源重组的特点
1.形成部分二倍体
Hfr×F－由于供体的染色体一段一段转移到F－。
且它们间的接合随时会断裂。
所以F－得到的位置是Hfr的部分基因形成部分合子。
又因为致育基因位于大肠杆菌基因的最后，所以只有当Hfr的基因全部转移进去，致育基因才转进入。
部分二倍体：
这种含有一个亲体F－全部基因组和另一亲体部分基因组的合子叫部分合子/部分二倍体。
2.偶数次交换，形成有活性的重组体
部分二倍体中，假如发生一次交换，只产生二倍性线状体，在分裂过程中被淘汰，只有发生偶数次交换，才产生有活性的重组体。
单交换二倍体线状体，双交换重组体＋线性片断。
偶次交换结果：
只产生一种重组体，而无相应的重组体。
二、细菌转化重组机制
用体外DNA片段的模式反应表示RecA蛋白的活性
三、细菌的接合与转导中的重组机制
1、细菌接合中的重组机制
其机制与转化类似，但更复杂。
其单链更长。
2、细菌转导中的重组机制
其重组发生在双链DNA片段与完整DNA分子之间，发生2次交换，需要RecA、RecBC蛋白的参与。
▪普遍性转导的重组机制
▪特异性转导的重组机制
第三节位点专一性重组
一、噬菌体的溶菌周期和溶源周期
感染周期：
是指噬菌体从吸附细菌到子代噬菌体从宿主细菌细胞中放出来的过程。
（一） 烈性噬菌体的感染周期：
eg 烈性噬菌体T4，其宿主是大肠杆菌，故称之为大肠杆菌T4－噬菌体。
T4－噬菌体对大肠杆菌的侵染过程，就是我们在前面讲过的噬菌体感染周期。
T4－噬菌体由头、尾两部分组成，外为蛋白质外壳＋内部DNA分子。
侵染时T4噬菌体的尾部吸附在大肠杆菌的细胞壁上，放出溶菌酶将细胞壁溶成一小孔，借助于尾鞘的收缩，将自己的DNA（T4－DNA）通过小孔注入大肠杆菌细胞内，T4－噬菌体的基因e立即有顺序地进行表达：
①首先早前期基因表达，这些多为调节基因，其作用是启动自身基因表达。
而抑制宿主大肠杆菌细胞的DNA合成。
②晚前期基因表达，这些是与DNA复制有关的基因。
其产物是：
核酸酶：
降解大肠杆菌的DNA，为自己DNA合成提供游离的核苷酸；DNA复制有关的酶：
大量合成新T4－DNA。
③晚期基因表达-是控制形态发生过程的基因；编码噬菌体结构蛋白的基因。
其产物是大部分直接参与外壳的建成和少数具有酶的作用。
T4－噬菌体DNA上约有160个基因，已定位的有70多个基因，装配成完整的噬菌体的全部信息也都在此DNA上。
④包装完成后，由噬菌体裂解基因表达，产生裂解酶。
消化宿主细胞壁。
大肠杆菌细胞裂解，放出大量的子代T4－噬菌体。
（二） 温和噬菌体的感染周期
eg：
－噬菌体，其宿主是大肠杆菌。
感染宿主。
噬菌体基因有顺序地表达。
①先是早期基因和部分晚期基因的表达。
产物--阻遏蛋白。
作用--调节或抑制自身其它基因的表达。
②噬菌体的整个基因组整合到宿主染色体的特定区域，噬菌体的大部分基因处于失活状态，随宿主染色体一起复制。
原噬菌体：
整合到宿主染色体中的噬菌体基因组，称为原－噬菌体。
溶源性细菌：
带有原－phage的细菌叫溶源性细菌。
以上过程称为溶源周期。
溶源性细菌具有2个重要特性：
①免疫性：
由于大肠杆菌含原噬菌体而产生一种阻遏蛋白（I）。
这种阻遏蛋白不但可抑制原噬菌体DNA复制。
也可抑制再度感染的同类噬菌体DNA的复制。
故能抵抗同类噬菌体的超感染。
②可诱导性：
原－phage的自发诱导，每一代可能有1/10000溶源性细菌被裂解，释放出大量－phage，这一过程为裂解周期。
失去原－phage的细菌称为非溶源性细菌。
假如用紫外线或化学物质（丝裂霉素C）诱导，90％溶源细菌进入裂解周期。
－phage的基因有顺序地表达，－phage的DNA独立复制，形成蛋白质外壳，从而组装成完整的噬菌体释放出来。
象这种在感染周期中具有裂解和溶源两种途经的噬菌体称为温和噬菌体。
二、噬菌体的整合和切除
▪如进入溶源状态，则DNA将整合到宿主基因组中；
▪由溶源状态转为裂解生长状态，则DNA从宿主DNA上切除下来。
附着位点（attachmentsite简写为att）
▪大肠杆菌上的att位点：
att或attB，其长度大约为25bp，位于bio和gal两基因之间，包含B、O、B`三个序列组分。
▪DNA上的att位点：
attP，其长度为240bp。
由P、O、P`三个序列组分组成，
整合反应：
BOB`+POP`（噬菌体）
IHF↓Int
BOP`—POB`（原噬菌体）
噬菌体的位点专一性重组
切除反应：
BOP`—POB`（原噬菌体）
IHF↓Int，Xis
BOB`+POP`（噬菌体）
噬菌体的位点专一性重组
三、位点专一性重组的核苷酸序列
▪核心序列：
“O”，含15bp，富含A-T对，序列内无碱基回文对称性。
▪attP：
4个Int结合位点、3个IHF结合位点。
▪attB：
1个Int结合位点（15bp）。
第四节同源重组的分子机制
一、异源DNA双链的断裂与重接
用图片说明
二、同源重组的Holliday模型
▪RobinHolliday于1964年提出了重组的杂合DNA模型（hybridDNAmodel）
异源双链：
在重组位点上，每个双链都有一个由两个亲本DNA分子中的一股单链共同组成的双链区，称为hybridDNA/heteroduplex
分支迁移：
两个双螺旋形成的交叉连接是两个原来的分子等量碱基交换的所在，交叉连接很容易以拉链式效应扩散，即链交换可沿着双链滑动，这个过程称为branchmigration。
连接分子的拆分：
▪切口发生在形成连接分子中原先没有切割过的配对链上
▪切口发生在重组过程中曾并切开过的一对同源单链上
三、基因转变及其分子机制
1、异常分离与基因转变
Mitchell设计实验：
▪pdxp：
不能合成维生素B6，对pH敏感。
▪pdx：
不能合成维生素B6，对pH不敏感
2、基因转变的类型
▪染色单体转变
▪半染色单体转变
3、基因转变的分子机制
第五节异常重组
一、原核生物中的转座因子（transposableelements）
1、插入序列（insertonsequenceIS）
•20世纪60年代末Starlinger在大肠杆菌中发现半乳糖基因的突变体，称为gal-。
•gal-：
由于DNA片段插入而形成产生的（插入序列）
•插入序列：
是发现的最小的一种转座因子，称为IS1。
•其全部序列已在1978年由H.Ohtsubo和E.Ohtsubo测定。
其全长为768bp，两端有18/23bp的反向重复序列。
某些插入序列的参数
元件
长度（bp）
末端反向重复（bp）
靶位点反向重复（bp）
靶位点选择
IS1
768
23
9
随意
IS2
1327
41
5
热点
IS4
1428
18
11/12
AAAN20TTT
IS5
1195
16
4
热点
2、转座子（transposon，Tn）（复合转座子）
是由两个重复序列夹着携带抗药性物标记的中央区段（含一个/多个结构基因），常以Tn和后面加数码来命名。
Tn的特征
转座子
抗性标记
长度/bp
末端IS序列的长度/bp
末端IS序列的方向
Tn5
卡那霉素
5400
IS50（1500）
反向
Tn9
氯霉素
2638
IS1（768）
正向
Tn10
四环素
9300
IS10（1400）
反向
Tn204
氯霉素、梭链孢酸
2457
IS1（768）
正向
Tn903
卡那霉素
3100
IS903（1050）
反向
Tn1681
潮霉素
2088
IS1（768）
反向
3、转座噬菌体（Mu，mutatorphage）
▪由Taylor于1963年发现的一种特殊的噬菌体，它是大肠杆菌的温和噬菌体。
▪Mu的特点：
几乎可以插入宿主染色体任何一个位置上。
而且游离Mu和已经插入的Mu基因次序是相同的。
另外它的两端没有粘性末端，同时插入某基因中就引起该基因突变。
二、真核生物的转座子
1、酵母菌的转座子
目前在酵母中研究得较清楚的转座子是Ty系列（transponsonyeast，Ty）。
为6300bp，两端含有两个称为δ的正向重复序列，正向重复序列的长度约250bp。
Ty插入酵母菌染色体后，受体上就会出现5bp的正向重复序列，这和细菌中转座子作用相似。
啤酒酵母中有控制a与α两种接合型的两个基因a与α。
这两个基因都能转座，当a基因从它的座位HMR转座到MAT座位后就能表达，细胞成为a接合型。
当α基因从它的HML转座到MAT座位后，原来在MAT座位上的a基因消失，α基因得以表达，细胞就转换成α接合型。
表明这两个转座子具有明显的生理功能，它们与其它转座子不同之处是只能转座到MAT上，而其它转座子几乎可以转座到该基因组中任何座位上。
2、果蝇的转座子
从20世纪70年代以来，在黑腹果蝇的一些品系间杂交子代出现某些异常现象，如卵巢发育不全、分离比异常、雄性个体的减数分裂中出现重组、高突变率、染色体畸变等。
这种现象称为杂种劣育（hybriddysgenesis）。
直到1977年M.G.Kidwell等第一次证实杂种劣育只出现在某杂交组合中，如黑腹果蝇有M品系（maternalstrains）与P品系（paternalstrains），只有M雌P雄杂交F1出现杂种劣育。
研究证明这是因为在P品系的细胞中有导致杂种劣育的遗传因子，称为P因子（Pelement）。
P因子与细菌中的转座子有许多相似之处：
P因子的全长是2907bp，两端有31bp的反向重复序列。
P因子有4个编码区、3个内含子。
体细胞中只有内含子1、2能被顺利切除，产生包括外显子0、1、2的功能型mRNA，被被翻译成一个相对分子量为6.6104的转座阻遏蛋白--一种转座活性的抑制因子。
在生殖细胞中内含子1、2、3均被切除，产生的成熟mRNA包括全部4个外显子并被翻译成相对分子量为8.7104转座酶，才能导致P因子转座和配子败育。
因为在体细胞中存在一个与外显子3特异结合的蛋白，这种蛋白与RNA的结合妨碍了内含子3的剪接。
研究发现果蝇的细胞质因子与P因子转座有关，只有在M雌P雄杂交F1出现杂种劣育是因为M雌性细胞质内缺失一个相对分子量为的6.6107转座阻遏蛋白，因此引起了P的雄性细胞核染色体上的P转座子自由转座，后代劣育。
P因子可以从原来的位置上消失：
这一过程称为切离（excision）。
准确的切离可以使得由于P因子插入而引起的突变型发生回复突变，，同时P因子也全部从插入位置上消失。
不准确的切离可以带来染色体畸变，P因子或是全部消失或是有一部分残留在染色体上。
P因子的位置和数目：
用同位素标记的P因子克隆作为探针，测得不同的果蝇品系的基因组中P因子的位置、数目均不相同。
引起插入突变：
P因子的插入而发生突变的基因有白眼（w）、焦刚毛（sn）、黄体（y）等。
这类突变基因中都可通过原位杂交的方法来证明P因子的存在。
果蝇中的转座子除了P因子外还有Copia、412、279、Tip、FB等。
3、玉米的转座子
美国遗传学家B.McClintock于1951年第一次提出转座子的概念，当时她把这种可以转移的染色体因子称为抑制基因（inhibitor，I）。
已经发现控制玉米糊粉层颜色至少有5对相关基因：
A（形成花色素）与a（无花色素）、C（代表颜色）与c（无色）、R（代表红色）与r（无色）、Pr（代表紫色）与pr（无色）、I（抑制C的效应）与i。
已知I和C都在玉米的第九对染色体上，且两者的座位相距很近。
进一步实验证明C与I基因之间容易发生断裂，其结果是使I基因转座到原来染色体的其他部位或者是别的染色体上，于是C恢复活性表现有色。
因此原来定名的I基因后改称为解离因子（dissociator，Ds）。
如果Ds因子停留在原来的座位，并未发生断裂和转座，则玉米籽粒为无色，如果籽粒在胚乳发育过程，细胞有丝分裂中Ds发生转座，而且转座愈早，则C基因恢复活性细胞愈多，将会出现大片带色的组织，转座愈晚则带色斑点组织愈小。
由此形成玉米籽粒上带有大小面积不同的紫白掺合的花斑类型。
为什么Ds既能停留在原位，对C基因起着抑制作用，又能在玉米籽粒发育的不同阶段发生断裂和转座呢？
McClintock深入研究证明，Ds的作用还要受到另一个基因的控制，这个基因她称为激活因子（activator，Ac），Ac和Ds往往在不同的染色体上，显然Ac是通过所产生的某种扩散性物质作用于Ds的。
在没有Ac的情况下籽粒为无色，但是当Ac从1个增加到2个或3个时，籽粒上带色斑点反而减少了，这说明Ac剂量的增加不是提前而是推迟了Ds因子的解离和转座。
接着她又发现Ds和Ac都可以转座，插入到一些基因中，并使这些基因发生突变，它们的消失又会使突变基因发生回复突变。
不过Ac的作用是自主的，而Ds的行为却依赖于Ac的作。
这是因为Ds和Ac在很大程度上表现出核昔酸序列的同源，特别是两端的序列是相同的，只是Ds因子不同程度地缺失了中间序列，正是由于这些序列的缺失，有可能丢失产生转座所需的有关酶的功能。
玉米中除了Ds一Ac系统以外，至少还有5个转座子系统都是由2个座成分组成，这也是玉米和其他真核生物转座子的一个重要的区别。
第六节转座的机制和遗传学效应
一、转座机制
人们对于转座机制进行了广泛的研究，一些转座模型是在各种离体实验结果的基础上被提出。
一个合理的转座机制的模型至少要说明下列现象：
[1]转座以后原来位置上的转座子保持不变。
[2]在新的位置上的转座子的两侧出现正向重复序列。
[3]转座过程出现共联体。
研究得比较清的还是细菌中的转座子，这里以细菌的转座5子为例说明转座的一般过程。
1979年J.A.Shapio提出了一个Tn3转座模型，大体分4步：
a、切开（cutting）：
含有Tn3转座子的供体质粒，其Tn3中转座酶有两种功能，第一可以识别受体质粒上的靶（target）序列，并在该序列两侧各一条单链上造成一个切口，切口之间的距离决定了转座后两侧正向重复序列的长度。
第二可以识别自身两边的反向重复序列，并在3`端切开。
b、连接（rejoining）：
供体和受体结合成为共联体（cointegrate），所谓共联体，就是两个或两个以上的复制子（replicon）通过共价连接起来的一个复制子。
其过程是使供体切下IS或Tn3反向重复序列末端和受体粘性末端以共价链齐头相连，形成两个"缺口"。
C、复制：
由DNA多聚酶进行修补复制补上缺口，由连接酶连接。
于是在IS两端形成了两个正向重复序列，一般为5~9bp，最长的12bp。
d、重组：
在特定位点进行重组，结果共联体分离形成两部分，一个是原来含有转座子的序列，另一个是通过转座插入了转座子的序列（p222图8一23）。
由此可见，转座子是以它的一个复制品转移到另一位置的，而在原来位置上仍然保自着原有的转座子（p223图8一24）。
Shapiro所提出的转座模型不仅可以说明上述3方面的现象，且说明转座过程是遗传重组过程。
这种重组发生在特定的位点，从这一层意义上说，转座过程是一种位点专一性重组，但是这种重组伴随着DNA的合成，所以是复制式的位点专一性重组/异常重组。
二、转座子的遗传学效应
有以下几个方面：
（1）引起插入突变：
各种IS、Tn3和噬菌体Mu以及真核生物中的转座子都可以引起插入突变，如插入位置是一个操纵子的上游基因那么将会造成极性突变。
（2）插入位置上出现新的基因：
如Tn上带有抗性基因，那么它不但造成一个基因的插入突变，同时在这一位点上出现一个新的抗药性基因。
（3）原来位置上保持原有的转座子：
实验证明转座子是以它的一个复制品转移到另一位置，而在原来位置上保留着原有的转座子。
（4）造成插入位置上受体DNA形成5~11bp的正向重复序列：
不同的转座酶识别切开位点不同而造成重复碱基对数不同，如3/IS3，5/Tn3，9/IS1，9/Tn10，11/IS4等等。
（5）改变染色体结构：
主要促使染色体缺失、倒位等染色体畸变。
（6）切离：
转座子可以从原来位置上消失，这一过程称为切离。
准确的切离使插入失活的基因发生回复突变，不准确的切离则不发生回复突变，而是带来染色体畸变。
（7）调节基因活动的开关：
如啤酒酵母两种接合类型的相互转化。
玉米籽粒各种花斑类型显然是Ds和Ac等各种基因相互作用的结果，这里Ac起着调节因子的作用，而Ds则相当于大肠杆菌乳糖操纵子中的调节基因。
（8）增加同源序列的整合：
如IS既可插入染色体不同位置，又可插入质粒上，大肠杆菌F因子和染色体上都发现IS，由此构成F因子和大肠杆菌染色体上存在一些相同的插入序列，如IS1、IS2等，通过同源序列间重组，F因子就插入染色体而成为Hfr菌株。
（9）产生新的变异，有利于进化：
由于转座子也可以携带其他基因进行转座，形成重新组合的基因型，以及通过转座形成大片段插入，引起缺失、倒位均会造成新的变异。
这些新的变异对生物的适应性以及进化会起到积极的作用。
转座子除了本身的遗传学效应外，在许多方面是遗传学研究中的一个有用的工具。
如作为基因转导的供体、基因定位的标记，基因克隆等方面都可利用转座子作为工具。
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