DNA基础知识.docx

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DNA基础知识

Chelex法提取血液（斑）DNA

原理:

Chelex是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子的作用，防止在其煮沸过程中DNA的降解，在高温低离子强度下也起着催化DNA释放的作用。

对检材的条件要求

液体血用EDTA溶液（0.5MEDTA：

血=50μl：

3ml）或枸橼酸钠溶液（2.5%枸橼酸钠：

血=1：

4）抗凝，勿用肝素抗凝，须冷藏保存送检。

操作步骤:

1、取4μl血液（或3×3mm2血斑样品）放入0.5ml的离心管中，加入0.5ml纯水，振荡混匀，室温浸泡15-30分钟。

2、13,000rpm离心3分钟，去除上清液〔上清液可用于做抗人血红蛋白（FOB）金标试剂条检验〕，若是血斑则保留载体。

3、加入200μl5%Chelex-100溶液，56oC保温15-30分钟，振荡5-10秒。

4、沸水中煮8分钟（或在热循环仪上100oC保温8分钟），振荡5-10秒。

5、13,000rpm离心3分钟，4oC保存备用。

注意事项：

1、5%Chelex-100溶液使用前摇匀，用量视检材的量而定。

2、液体血用EDTA溶液（0.5MEDTA：

血=50μl：

3ml）或枸橼酸钠溶液（2.5%枸橼酸钠：

血=1：

4）抗凝，冷藏送检。

3、液体血涂在滤纸或脱脂纱布上制成血斑时，应在室温下自然晾干，放入纸袋内送检。

4、血斑应保留载体，皮革上的血迹最好用纱线转移提取。

5、纯水洗一次后，若颜色还很红，可用水再洗一遍。

6、微量血斑可不经水洗，直接加入适量5%Chelex-100溶液保温。

7、陈旧血斑可加入蛋白酶K，并适当延长保温时间。

Chelex法提取唾液（斑）DNA

适用范围：

该方法适用于各种载体上的唾液斑，常见的有口腔拭子、烟蒂、邮票、信封折口、

牙刷、果核、饮料罐、水杯、面罩及咬痕等。

原理：

Chelex是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子的作用，防止在其煮沸过程中DNA的降解，在高温低离子强度下也起着催化DNA释放的作用。

在Chelex中加入蛋白酶K，有助于口腔上皮细胞的消化。

操作步骤

1、取3×3mm2唾液斑样品（过滤嘴纸质外层、唾液斑转移纱线）或剪取牙刷刷毛1束，放入0.5ml的离心管中，加入0.5ml纯水，振荡混匀，室温浸泡15-30分钟。

2、13,000rpm离心3分钟，去除上清液，保留载体。

3、加入100μl5%Chelex-100溶液和5μl2mg/ml蛋白酶K，56°C保温2小时以上，

振荡5-10秒。

4、沸水中煮8分钟（或在热循环仪上100°C保温8分钟），振荡5-10秒。

5、13,000rpm离心3分钟，4°C保存备用。

注意事项：

1、多枚烟蒂应分别放入不同纸袋内送检，标明商标和提取地点。

2、口腔拭子应在室温下自然晾干，放纸袋内送检。

3、饮料罐、水杯口上的唾液斑可分两步提取转移，先用湿棉签或纱布擦拭，再用干棉签或纱布擦拭，一并放入离心管中提取DNA。

擦拭时尽量少用载体。

4、对于量少的检材可不经水洗，直接加入5%Chelex-100溶液和蛋白酶K保温。

Chelex法提取组织DNA

适用范围：

人体的各种器官组织如心脏、脑、肌肉、软骨及毛根等。

原理：

Chelex是由苯乙烯与二乙烯苯的共聚体组成的螯合树脂，其亚氨基二乙酸侧链起着螯合金属离子的作用，防止在其煮沸过程中DNA的降解，在高温低离子强度下也起着催化DNA释放的作用。

在5%的Chelex-100中加入蛋白酶K溶液，有助于组织细胞的消化和DNA释放。

操作步骤

1、剪取组织约1mg，放入0.5ml的离心管中，加入200μl5%Chelex-100溶液和10μl的2mg/ml蛋白酶K；剪单根毛发的毛根，加入50μl5%Chelex-100溶液和5μl2mg/ml的蛋白酶K，56ºC保温2小时以上，振荡5-10秒。

2、沸水中煮8分钟（或在热循环仪上100ºC保温8分钟），振荡5-10秒。

3、13,000rpm离心3分钟，4ºC保存备用。

注意事项

1、焚烧的尸体应取深层肌肉，严重腐烂尸体应提取软骨。

2、多根毛发的毛根应分别提取DNA。

3、带毛根的毛发干燥状态下保存送检，组织应冷冻保存送检。

4、组织DNA含量较大，取材时不要过量。

5、若组织表面较脏，应先用纯水冲洗，去除烟尘、泥土等杂质。

6、毛根表面若粘有血迹或其他斑迹，应先用脱脂棉蘸纯水擦拭干净。

Chelex法提取指（趾）甲DNA

适用范围

该方法适用于人类指（趾）甲。

原理

指（趾）甲的主要成份为α-角蛋白，也含有人体细胞。

在二硫代苏糖醇（DTT）存在的条件下，蛋白酶K可将α-角蛋白水解，在高温下破坏细胞内的膜结构，释放出细胞内的线粒体DNA、核DNA。

对检材的条件要求

样品表面清洁，面积在5mm2以上。

操作步骤

1、清洁指（趾）甲的表面：

先用洗涤剂或去污剂的稀释溶液擦洗指（趾）甲的表面，然后用手术刀片再刮

去一层表面，最后用纯水清洗，取出后用滤纸压干。

2、将适量指（趾）甲样品剪为碎片，转移至0.5ml的离心管中，加入100µl5%Chelex-100溶液，10µl4MDTT溶液，10µl5mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56°C保温4小时以上。

3、沸水中煮8分钟（或在热循环仪上100ºC保温8分钟），振荡5-10秒。

4、13,000rpm离心5分钟，4°C保存备用。

注意事项

1、对于一些难于酶解的检材可以适时、适量补加蛋白酶K。

2、Chelex法提取后的检材，可使用Promega公司的DNAIQ系统进行纯化，浓缩。

Chelex-100法提取混合斑中女性DNA

适用范围

该方法适用于混合斑中女性DNA的提取。

原理

在没有DTT存在的情况下，混合斑中的精子不会裂解释放出DNA，用Chelex-100法提取到的混合斑中DNA主要为女性DNA。

操作步骤

1、取3×3mm2混合斑检材放入0.5ml的离心管中，加入200μl5%Chelex-100溶液和10μl2mg/ml蛋白酶K，56ºC保温1小时以上，振荡5-10秒。

2、13,000rpm离心3分钟，吸取上清液至0.5ml的离心管中，沸水中煮8分钟（或在热循环仪上100ºC保温8分钟），振荡5-10秒。

3、13,000rpm离心3分钟，4ºC保存备用。

注意事项

1、通常STR检验分型结果为单一的女性基因型，男性谱带的峰值很低，与背景噪音相当。

2、特殊情形下，如混合斑中若混有男性血或含有大量男性上皮细胞等，则STR分型为混合谱带。

Chelex法提取混合斑中精子DNA

适用范围

该方法适用于阴道拭子和各种载体上含有精子的混合斑。

原理

利用女性上皮细胞与精子结构上的差异，首先在蛋白酶K和SDS作用下裂解上皮细胞，分离去除上清（女性DNA）、保留沉淀（精子的头部），漂洗去除残留的女性DNA；在DTT、蛋白酶K、Chelex（螯合树脂，防止煮沸过程中DNA的降解）存在的情况下，进行二次消化，释放出精子DNA。

操作步骤

1、将带有精子的检材约2cm2剪碎，装入1.5ml离心管A中，加lmlTNE溶液或去离子水，37℃浸泡30分钟。

〔可13000rpm离心3分钟，后取100ul上清溶液做抗人前列腺特异抗原（PSA）金标试剂条检验，再在A管中补加100ul的TNE，振荡〕然后加入10%SDS（约100ul）至终浓度1%，加蛋白酶K（约10ul）至终浓度100ug/ml，37℃保温2小时以上（时间长些效果会更好，因而可过夜）。

2、套管离心（将A管底部用针穿一个洞，套在另一个管B中），13000rpm离心5分钟（或可用5000rpm离心10分钟、或可用10000rpm离心8分钟），弃A管。

3、弃B管中上清液，沉淀物加入1mlTNE溶液或去离子水振荡重悬，13000rpm离心5分钟离心，弃上清液；如此反复漂洗一至五次，后B管中保留20-30ul的液量做精子DNA提取。

（沉淀物可保留一半以备女性物质去除不净时再次进行消化。

）

4、沉淀物中加入200ul5%Chelex-l00溶液、20ul10mg/ml蛋白酶K和10ul1MDTT，56℃30分钟至4小时（或过夜）。

5、振荡5-10秒，98℃8-10分钟，振荡5-10秒。

6、13000rpm离心3分钟，4℃或-20℃保存备用。

注意事项

1、检材用量不要过大，以利于充分浸泡、消化，并避免DNA模板浓度过高，导致小片段优势扩增。

2、女性物质过多时，可延长第一步消化时间，增加漂洗次数;或将保留的一半沉淀物再次进行消化。

3、遇有抑制物干扰时，可通过稀释或用DNAIQ系统纯化模板DNA来解决。

DNAIQ系统纯化DNA

适用范围

该方法适用于DNA的纯化。

原理

本方法运用DNAIQ系统，对有机法和Chelex-100法提取的DNA进行纯化。

在高浓度chaotropicsalt（NaI、硫氰酸胍和盐酸胍等）存在的条件下，核酸吸附到二氧化硅上，而在低盐条件下被洗脱下来。

操作步骤

1、剪取适量检材于1.5ml离心管中，加200ul配制好的裂解液（100ul裂解液+1ul1MDTT），95℃保温30分钟；

2、套管离心，去掉载体，将上清液转移至另一个1.5ml的离心管；

3、离心管中加入2倍体积配制好的裂解液和7ul树脂，漩涡振荡使树脂悬浮，室温放置5分钟，期间震荡3-5次，以使树脂保持悬浮；

4、旋涡振荡后将离心管置于磁架上，小心弃去液体；

5、加100ul配制好的裂解液，旋涡振荡使树脂悬浮，将离心管放在磁力架上，小心弃去液体；

6、加100ul配制好的1х洗液（2х洗液：

无水乙醇：

异丙醇=2：

1：

1），旋涡振荡使树脂充分悬浮，将离心管放在磁力架上，小心弃去液体；

7、重复三次步骤7，最后一次尽量将上清液吸干净；

8、打开离心管盖子，室温下空气干燥5分钟；

9、加入50ul纯水，旋涡振荡使树脂悬浮，离心管放在加热块上，65℃保温5分钟，期间振荡3-5次;

10、取出离心管，旋涡振荡使树脂悬浮后，立即将离心管置于磁力架上，小心将DNA溶液吸出至干净管中备用；

注意事项

1、待纯化的样品在加入裂解液后仍呈粘稠状，会影响磁铁架吸附树脂，导致离心管放入磁架后树脂不贴壁，仍呈悬浮状，此时应用裂解液进一步稀释，或步可将样品在56℃加热1分钟，溶液即可澄清；

。

2、每步应尽量吸净液体。

3、旋涡振荡充分，使树脂在每次洗涤中不发生凝结。

4、干燥时间不要超过20分钟。

5、低温洗脱导致回收率低，洗脱时应置65o保温5分钟。

6、7μl树脂只能吸附约100ngDNA，因此无需加入过多的DNA。

Micoron100柱纯化方法

1、分别标记两个编号一样的1.5ml管×（A管、B管）；

2、将已用CHELEX100法或有机法等已制备好的DNA，13000rpm离心3分钟；

3、将micoron100柱放在离心管A上，往柱子里加适量已制备的DNA（约30-50ul即可），再往柱子里加100ul去离子水，盖上盖子；

4、将离心管A（套有柱子）1000rpm离心5-10分钟（柱子内约保留20-30ul的溶液）；

5、从离心管A上拆下micoron-100柱（弃A管），将micoron-100柱翻转后放在离心管B上，盖上盖子；

6、将离心管B（套有柱子）13000rpm离心5分钟；

7、弃柱子，收集的DNA溶液保留在离心管B中备用。

抗人血红蛋白（anti-Hb）金标试剂条检验人血液（斑）

适用范围

该方法适用于疑含有人血的所有检材。

原理

抗人血红蛋白金标试剂条检验人血的基本原理是双抗体夹心法。

吸附于试剂条加样区的金标记单克隆抗人Hb抗体与含有人血的检材（样本）浸泡液反应后，形成金标记抗体抗原复合物，并向试剂条吸附区扩散，当扩散至试剂条预粘附有线性未标记的单克隆抗人Hb处时，与未标记的单克隆抗人Hb反应，并沉淀于该处，形成紫红色沉淀带（检测线）。

如果检材（样本）浸泡液中无Hb则不能形成紫红色沉淀带。

吸附于试剂条加样区的多余金标记单克隆抗人Hb抗体越过检测线，继续向试剂条吸附区扩散，当扩散至试剂条预粘附有线性标记的羊抗鼠IgG处时，形成紫红色沉淀带（质控线）。

对检材的条件要求

人血稀释8万倍以下或人Hb含量1000ng/ml以上。

操作步骤

剪取适量大小疑含有人血斑检材或吸取适量疑含有人血液检材，于0.5ml离心管内，加入450μl纯水，室温放置30分钟，不时振荡，13,000rpm，5分钟，移上清于另一0.5ml离心管内，将试剂条带MAX标记一端插入上清中，室温静置5分钟，观察结果。

结果

阳性:

阳性二条带，质控线及检测线均为阳性。

加样区反应区吸附区

检测线质控线

阴性一条带，仅有质控线。

注意事项

1、视检材情况确定检材取量、纯水用量及浸泡时间。

一般检材室温浸泡30分钟，陈旧检材可4℃浸泡过夜。

2、试剂条应置于检材浸泡离心上清液内（不应超过MAX线）5分钟内观察结果。

3、试剂条质控线阳性时结果判断才有效。

4、假阴性的原因包括检材太浓而表现为前滞作用或试剂条灵敏度低等。

5、假阳性的原因包括抗体的非特异性反应或试剂条反应后久置等。

6、试剂条应在室温干燥条件下保存，在有效期内使用。

抗人前列腺特异抗原（PSA）金标试剂条检验人精液（斑）

适用范围

该方法适用于疑含有人前列腺特异蛋白的所有检材，主要为与性犯罪有关的精液（斑），包括阴道、口腔、肛门、皮肤擦拭物、卫生纸、衣物等可能粘附有人精液（斑）的所有生物检材。

原理

抗人前列腺特异抗原PSA金标试剂条检验人精液（斑）的基本原理是双抗体夹心吸附于试剂条加样区的金标记单克隆抗人PSA抗体与含有人精液（斑）斑的检材（样本）浸泡液反应后，形成金标记抗体抗原复合物，并向试剂条吸附区扩散，当扩散至试剂条预粘附有线性未标记的单克隆抗人PSA处时，与未标记的单克隆抗人PSA反应，并沉淀于该处，形成紫红色沉淀带（检测线）。

如果检材（样本）浸泡液中无PSA则不能形成紫红色沉淀带。

吸附于试剂条加样区的多余金标记单克隆抗人PSA抗体越过检测线，继续向试剂条吸附区扩散，当扩散至试剂条预粘附有线性标记的羊抗鼠IgG处时，形成紫红色沉淀带（质控线）。

对检材的条件要求

人精液稀释4万倍以下或人精液特异蛋白含量100ng/ml以上。

操作步骤

剪取适量大小疑含有人精斑检材或吸取适量疑含有人精液检材，于0.5ml或1.5ml离心管内，加入450μl或1ml纯水，室温浸泡30分钟，期间反复搅动，13,000rpm，5分钟，将试剂条带MAX标记一端插入上清中，室温静置5分钟，观察结果。

结果

阳性:

阳性二条带，质控线及检测线均为阳性。

加样区反应区吸附区

检测线质控线

阴性一条带，仅有质控线。

注意事项

1、视检材情况确定检材取量、纯水用量及浸泡时间。

陈旧检材室温浸泡30分钟后再反复搅动离心后检验。

2、试剂条应置于检材浸泡离心上清液内（不应超过MAX线）5分钟内观察结果。

3、试剂条质控线阳性时结果判断才有效。

4、假阴性的原因包括检材太浓而表现为前滞作用或试剂条灵敏度低等。

5、试剂条应室温干燥保存，在有效期内使用。

有机法提取血液DNA

适用范围

该方法适用于提取抗凝血中大分子基因组DNA。

原理

先用2×蔗糖-TritonX-100溶液破红细胞，离心收集白细胞核，裂解核膜，释放出染色体DNA，经蛋白酶消化，蛋白变性剂处理去除其中的蛋白质，再经乙醇沉淀获得纯DNA。

操作步骤

1、取抗凝血3ml（或3×3mm2血斑样品），加入等体积的2×蔗糖-TritonX-100溶液，颠倒混匀至液体透亮。

2、3,000rpm离心15分钟，小心去除上清液，得到细胞核沉淀。

3、用1mlEDTA-Na2溶液悬浮细胞核沉淀，移入匀浆器中匀浆。

4、匀浆液移至干净试管中，用0.7mlEDTA-Na2溶液冲洗匀浆器、回收。

5、向试管中加入200μl10%SDS溶液和100μl2mg/ml蛋白酶K溶液，缓慢转动试管混匀。

6、将试管放于37oC水浴中，反应4小时左右。

7、向试管中加入等体积的饱和酚，缓慢颠倒混匀5分钟。

8、3,000rpm离心10分钟，将上层水相移至干净试管中。

9、加等体积1：

1酚和氯仿混合液，颠倒混匀5分钟，重复步骤5.8。

10、加等体积的氯仿，颠倒混匀5分钟，重复步骤5.8。

11、加3MNaCl至终浓度0.3M混匀，然后加入2.5倍体积的冷无水乙醇，缓慢混匀，得到线团状DNA沉淀。

12、将DNA沉淀移至1.5ml离心管中，加1ml70%乙醇漂洗。

8,000rpm离心5分钟，倾掉液体，将沉淀于真空干燥器或37oC烘箱中干燥。

13、加100μlTE溶解，放4oC备用。

注意事项

1、保证重蒸饱和酚的质量。

2、提取过程中避免剧烈振荡。

3、酚-氯仿抽提时，避免扰动和吸到中间的蛋白质层。

有机法提取组织DNA

适用范围

该方法适用于提取组织中大分子基因组DNA。

原理

用蛋白酶K和表面活性剂裂解组织细胞，释放出DNA，经蛋白酶消化，蛋白变性剂处理去除其中的蛋白质，再经乙醇沉淀、获得纯DNA。

操作步骤

1、50mg组织剪碎，放入匀浆器中，加1mlEDTA-Na2溶液，匀浆。

2、液移至试管中，用0.7mlEDTA-Na2溶液冲洗匀浆器、回收。

3、管中加入200μl10%SDS溶液和100μl2mg/ml蛋白酶K溶液，缓慢转动试管混匀。

4、管放于37ºC水浴中，反应4小时左右。

5、管中加入等体积的饱和酚，缓慢颠倒混匀5分钟。

6、000rpm离心10分钟，将上层水相移至干净试管中。

7、体积1：

1酚和氯仿混合液，颠倒混匀5分钟，重复步骤5.6。

8、体积的氯仿，颠倒混匀5分钟，重复步骤5.6。

9、MNaCl至终浓度0.3M混匀，然后加入2.5倍体积的冷无水乙醇，缓慢混匀，得到线团状DNA沉淀。

10、A沉淀移至1.5ml离心管中，加1ml70%乙醇漂洗。

8,000rpm离心5分钟，倾掉液体，将沉淀于真空干燥器中或37ºC烘箱干燥。

11、0μlTE溶解，放4ºC备用。

AmpFlSTRIdentifiler试剂盒操作手册

AmpFlSTRIdentifiler试剂盒概况

新一代法医鉴定及亲子鉴定试剂盒AmpFlSTRIdentifilerPCR扩增试剂盒是一个多重短串联重复序列（STR）检测试剂盒。

它采用美国应用生物系统公司（ABI）最新的五色荧光、一个泳道技术，可以同时扩增和同时检测16个STR位点（15个4核苷酸重复位点加上Amelogenin性别判定标记）。

5色荧光中，6-FAM（兰色）、VIC（绿色）、NED（黄色）和PET（红色）用于标记样品，LIZ（橙黄色））用于标记GeneScan-500分子量内标。

AmpFLSTRIdentifilerPCR扩增试剂盒包含美国CombinedDNAIndexSystem（CODIS）所要求的全部13个位点，另外增加2个位点：

D2S1338和D19S433。

它整合了ABI公司先前推出的ProfilerPlus、COfiler和SGMPlus试剂盒中的全部STR位点，满足目前所有国际罪犯数据库的要求，如CODIS、ENFSI、Interpol以及SGMPlus体系。

AmpFlSTRIdentifiler试剂盒特点

1、单管同时扩增16个位点，包括15个个体识别位点以及一个性别鉴定位点Amelogenin。

2、采用与以往试剂盒完全相同的引物序列，所有位点扩增产物与ABI现有ProfilerPlus,COfiler及SGM试剂盒扩增结果完全一致，罪犯DNA数据库工作可以在不同试剂盒中自由切换。

3、五色荧光技术，实现了一色荧光标记分子量内标，其余四色荧光标记待测样品，在维持扩增产物大小不变的条件下，有效地提高了单个泳道可以分辨的片段数。

4、扩增产物小：

全部16个位点的PCR扩增产物均小于350bp，扩增效率及重现性高，支持DNA降解样品的扩增。

5、AmpFlSTRIdentifiler试剂盒的一个包装足以进行200次25μl反应体系的PCR扩增。

AmpFlSTRIdentifiler试剂盒位

保存方法

PCR扩增

AmpFlSTRIdentifiler扩增体系

AmpFlSTRIdentifiler试剂

体系

标准体系（25μL）

经济体系（10μL）

8μL

AmpFlSTRPCRReactionMix（缓冲液）

10.5μL

4μL

3μL

AmpFlSTRIdentifilerPrimerSet（引物）

5.5μL

2μL

1.8μL

AmpliTaqGoldDNAPolymerase（Taq酶）

0.5μL

0.2μL

0.2μL

水

2.8μL

2μL

DNA模板

10μL

1μL

1μL

AmpFlSTRY-filer扩增体系

试剂

体系

标准体系（25μL）

经济体系（10μL）

缓冲液

9.2μL

3.7μL

引物

5μL

2μL

Taq酶

0.8μL

0.3μL

水

3μL

DNA模板

10μL

1μL

按下述程序扩增DNA：

95℃11min→（94℃1min→59℃1min→72℃1min）×28个循环→60℃60min→4℃保温。

DNA保存

如果DNA保存时间小于2周，保存于2到6℃；如果DNA保存时间大于2周，保存于-15到-25℃。

电泳样品准备

按下表配制，用Hi-DiFormamide（甲酰胺）补充终体积至10μL。

每次电泳（15个样品）确认至少一个AmpFlSTRIdentifilerAllelicLadder。

Hi-DiFormamide（甲酰胺）

Hi-DiFormamide（甲酰胺）通常25ml/瓶，因而将其分装在1.5ml离心管内，1ml/管，-20℃保存。

9700PCR扩增仪作业指导书

操作规程：

1、接好电源插头。

2、按下电源开关。

3、滑开热盖，放入需扩增的样品于加热模块中，滑上热盖并压紧。

4、按F1选RUN，用上、下箭头选择需要扩增的程序文件，按START键，选择待扩增样品体积（5~100ul）,按START键开始扩增。

5、扩增结束后滑开热盖，取出样品，滑上热盖，关闭仪器。

保养内容：

1、需每周清洗外观。

2、每日用中性清洁剂清洁加热模块及热盖，防止潜在样品间相互污染。

3、需每日确认电源开关是否良好。

注意事项：

1、短时间内不得连续开关仪器；

2、扩增结束后及时取出样品，关闭仪器，仪器不宜长时间处于工作状态。

4、不得有其他物品堵塞仪器散热风口。

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