多肽合成关键技术.docx
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多肽合成关键技术
多肽化学已经走过了一百近年光辉历程，19，EmilFischer一方面开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面知识太少，进展也相称缓慢当时合成采用了苯甲酰，乙酰保护，脱去相称困难，并且容易导致肽链断裂。
直到1932年，MaxBergmann等人开始使用苄氧羰基（Z）来保护α-氨基，该保护基可以在催化氢化或氢溴酸条件下定量脱除，多肽合成才开始有了一定发展。
到了20世纪50年代，随着越来越多生物活性多肽发现，大大推动了有机化学家们对多肽合成办法以及保护基研究，因而这一阶段研究成果也非常丰富，人们合成了大量生物活性多肽，涉及催产素（oxytocin），胰岛素等，同步在多肽合成办法以及氨基酸保护基上面也获得了不少成绩，这为日后固相合成办法浮现也提供了实验和理论基本。
也就是这个阶段，FredSanger创造了氨基酸序列测定办法，并为此获得了1958年Nobel化学奖。
还是她日后创造了DNA序列检测办法，并于1980年再次获得了Nobel化学奖，成为到当前为止唯一获得两次Nobel化学奖科学家。
1963年，Merrifield提出了固相多肽合成办法（SPPS），这个在多肽化学上具备里程碑意义合成办法，一出来，就由于其合成以便，迅速，当前已经成为多肽合成首选办法，随后发展也证明了该办法不但仅是一种合成办法，并且也带来了有机合成上一次革命，并成为了一支独立学科，固相有机合成（SPOS）。
固然，Merrifield也因而荣获了1984年Nobel化学奖。
也正是Merrifield，她通过了重复筛选，最后屏弃了苄氧羰基（Z）在固相上使用，一方面将叔丁氧羰基（BOC）用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性条件下定量脱除，反映也非常迅速，在30min就可以反映完全。
由于叔丁氧羰基（BOC）办法中，氨基酸侧链保护基团大多基于苄基（Bzl），因而也称为BOC-Bzl方略。
同步，Merrifield在20世纪60年代末创造了第一台全自动多肽合成仪，并初次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。
随后多肽化学研究重要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基研究。
1972，LouCarpino一方面将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反映完全，并且由于其反映条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中首选合成办法。
该办法中氨基酸侧链大多基于叔丁基（But），因而，也称为FMOC-But方略。
同步，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，涉及合成环肽氨基酸正交保护上也获得了丰硕成果。
进入21世纪，随着蛋白质组学研究进一步，对于多肽化学规定不但仅是合成办法，而更多集中在多肽标记与修饰办法，以及蛋白构造与功能模仿多肽合成以及长肽或蛋白合成。
∙多肽化学合成基本简介
多肽化学合成办法，涉及液相和固相两种办法。
液相合成办法当前重要采用BOC和Z两种保护办法，当前重要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，具备保护基选取多，成本低廉，合成规模容易放大许多长处。
与固相合成比较，液相合成重要缺陷是，合成范畴小，普通都集中在10个氨基酸以内多肽合成，尚有合成中需要对中间体进行提纯，时间长，工作量大。
固相合成办法当前重要采用FMOC和BOC两种办法，它具备合成以便，迅速，容易实现自动化，并且可以比较容易合成到30个氨基酸左右多肽。
1.1．氨基酸保护基
20种常用氨基酸，依照侧链可以分为几类：
脂肪族氨基酸（Ala，Gly，Val，Leu，Ile，），芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（Asp，Glu，Asn，Gln），碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys，Met），含醇氨基酸（Ser，Thr），亚氨型基酸（Pro）。
多肽化学合成中氨基酸保护非常核心，直接决定了合成可以成功核心。
由于常用20中氨基酸中有诸多都是带有活性侧链，需要进行保护，普通规定，这些保护基在合成过程中稳定，无副反映，合成结束后可以完全定量脱除。
合成中需要进行保护氨基酸涉及：
Cys，Asp，Glu，His，Lys，Asn，Gln，Arg，Ser，Thr，Trp，Tyr。
需要进行保护基团：
羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。
其中Trp也可以不保护，由于吲哚性质比较稳定。
固然在特殊状况下，有些氨基酸也可以不保护，象，Asn，Gln，Thr，Tyr。
表1常用3种氨基脱除条件
TFA
HBr/TFA
H2/Pd-C
Piperidine/DMF
Boc
y
y
n
n
Z
n
y
y
n
Fmoc
n
y
n
y
图1常用3种氨基保护基构造
氨基酸侧链保护基团非常多，同一种侧链有各种不同保护基，可以在不同条件下选取性脱除，这点在环肽以及多肽修饰上具备很重要意义。
并且侧链保护基和选取合成办法有密切关系，液相和固相不同样，固相中BOC和FMOC方略也不同样，从某种意义上看，多肽化学就是氨基酸保护基灵活运用与搭配。
关于侧链保护基使用，请参照王德心《固相有机合成——原理及应用指南》第四章，咱们这里重要简介Cys，Lys，Asp几种保护基及其脱除办法。
Cys最常用保护基有三种，Trt，Acm，Mob，这三个保护基可以完毕多对二硫键多肽合成。
Lys最常用保护基有：
Boc，Fmoc，Trt，Dde，Allyl，这对于固相合成环肽提供了诸多正交保护方略。
Asp最常用保护基有：
Otbu，OBzl，OMe，OAll，OFm，同样也提供了各种正交保护方略。
表2巯基常用保护基
简称
构造
脱除条件
Trt
TFA，HCl/HOAc，I2/MeOH
Acm
I2/MeOH，Hg2+
Mob
HF，TFMSA，Hg2+
表3氨基常用保护基
简称
构造
脱除条件
Trt
TFA，HOAc，HCOOH
Boc
HCl/HOAc，TFA/DCM
Fmoc
Pip/DMF，NaOH/MeOH
Dde
H2NNH2/DMF
Allyl
Pd（Ph3P）4，吗啉/THF
表3羧基常用保护基
简称
构造
脱除条件
Otbu
TFA，HOAc，HCOOH
OBzl
H2/Pd，HF，TFMSA
OMe
NaOH/MeOH
OAll
Pd（Ph3P）4，吗啉/THF
OFm
Pip/DMF，DBU/DMF
1.2．多肽缩合试剂
当前多肽合成中，重要采用羧基活化办法来完毕接肽反映，最早使用是将氨基酸活化为酰氯，叠氮，对称酸酐以及混合酸酐办法，但是由于这些条件下，存在氨基酸消旋，以及反映试剂危险以及制备比较复杂，逐渐被日后缩合试剂取代，按照其构造可以分为两种：
缩合试剂重要有：
碳二亚胺型，鎓盐型（Uronium）。
1.2.1．碳二亚胺型
重要涉及：
DCC，DIC，EDC.HCl等。
采用DCC进行反映，由于反映中生成DCU，在DMF中溶解度很小，产生白色沉淀，因此普通不用在固相合成中，但是由于其价格便宜，在液相合成中，可以通过过滤除去，应用依然相称广泛。
EDC.HCl由于其水溶解性特点，在多肽与蛋白连接中使用比较多，并且也相称成功。
但是该类型缩合试剂一种最大缺陷，就是如果单独使用，会有比较多副反映，但是研究表白如果在活化过程中添加HOBt，HOAt等试剂，可以将其副反映控制在很低范畴。
其反映机理如下：
图2 DIC活化反映机理
1.2.2．鎓盐型
鎓盐型缩合试剂反映活性高，速度快，当前使用非常广泛，重要涉及：
HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。
该试剂使用过程中需要添加有机碱，如，二异丙基乙胺（DIEA），N-甲基吗啉（NMM），该试剂加入后，才干活化氨基酸。
其反映机理如下：
图3 TBTU活化反映机理
1.3．多肽合成办法比较
1.3.1．液相多肽合成（solutionphasesynthesis）
液相多肽合成当前依然广泛使用，在合成短肽和多肽片段上具备合成规模大，合成成本低明显长处，并且由于是在均相中进行反映，可以选取反映条件更加丰富，象某些催化氢化，碱性水解等条件，都可以使用，这在固相中，使用却由于反映效率低，以及副反映等因素，无法应用。
液相多肽合成中重要采用BOC和Z两种反映方略。
图4液相合成Glu-Trp
1.3.2．固相多肽合成
图5 FMOC固相合成Glu-Trp
固相多肽合成当前使用重要有两种方略：
BOC和FMOC两种。
BOC办法合成过程中，需要重复使用TFA脱BOC，并且在最后从树脂上切割下来需要使用HF，由于HF必要使用专门仪器进行操作，并且切割过程中容易产生副反映，因而当前使用受到实验条件限制，使用也逐渐减少。
FMOC办法反映条件温和，在普通实验条件下就可以进行合成，因而，也得到了非常广泛应用。
1.3.2.1．固相合成中惯用树脂
固相合成中树脂，普通都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm，交联度在1-2%之间，当前使用大多是1%，由于这种交联度下，树脂在DMF，DCM中具备较好溶胀性能，立体上是一种空间网状构造，反映物分子可以在树脂内部自由移动。
树脂中最核心某些是连接手臂，它一端连接在树脂上，一端作为反映位点。
当前广泛使用树脂有：
PAM，MBHA，Wang，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等。
其中PAM，MBHA是用在BOC方略中，由于其对酸非常稳定，需要在HF，TFMSA等强酸条件下才可以切割下来。
图6 固相合成惯用树脂
1.3.2.2．茚三酮检测
固相多肽合成中，重要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率，检测办法称为Kaiser办法，其检测成果，如果有游离氨基时候，显示兰色，或红褐色（pro，ser，His）。
Kaiser试剂涉及：
A，6%茚三酮乙醇溶液
B，80%苯酚乙醇溶液
C，2%0.001MKCN吡啶溶液
配制中吡啶需要通过茚三酮解决后，重蒸后再使用。
检测过程，取少量树脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加热1-2min，如果溶液有兰色，或树脂浮现兰色，红褐色，表白尚有游离氨基，否则阐明连接完全。
尚有其他检测游离氨基办法：
三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬兰法等。
图7茚三酮检测原理
1.3.2.3．固相合成切割办法
固相合成完毕之后，必要选取适当切割试剂将多肽从树脂上切割下来，然后通过冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，通过HPLC分离纯化，冷冻干燥得到最后产品。
由于选取树脂不同，氨基酸序列不同，在切割时候，选取切割办法也不完全相似，普通都是选取酸性条件下切割条件，对于PAM，MBHA树脂，普通采用HF切割，切割过程中需要添加对甲苯酚，对巯基苯酚，苯甲醚等试剂。
而对于Wang，Rink-Amide，Trt树脂，普通采用TFA切割，切割过程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三异丙基硅烷，苯酚等。
这些添加试剂重要作为碳正离子俘获试剂使用，目是俘获切割反映过程中生成碳正离子，减少这些碳正离子对某些氨基酸侧链攻打导致副反映，比较容易产生副反映氨基酸有：
Trp，Tyr。
切割试剂用量普通10-15ml/g树脂。
惯用切割配比：
HF/p-cresol/p-thiocresol（90/5/5），TFA/TIS/EDT/H2O（94/1/2.5/2.5），反映普通是在室温条件下2h-4h。
1.3.3．多肽合成中重要问题
1.3.3.1．消旋及其反映机理
多肽合成过程中，某些氨基酸在活化过程中会导致不同限度消旋，特别容易消旋氨基酸有：
Cys，His，Phe，固然这些消旋化还和溶剂，温度以及合成中有机碱等因素关于。
对于这些氨基酸，可以通过采用高效缩合试剂，减少反映时间，可以减少消旋比例，普通条件选取恰当，消旋化都可以控制在5%以内。
消旋反映机理如下：
图8消旋反映机理
1.3.3.2．二酮哌嗪（DKP）反映
DKP副反映出当前FMOC-Wang树脂合成过程中，重要出当前第一种氨基酸为Pro时候，当第二个氨基酸脱FMOC时候，α-氨基被游离出来之后，及时对Wang树脂苄酯键进行分子内胺解，生成六元环二酮哌嗪衍生物，同步从Wang树脂上释放出来，导致反映终结。
该反映非常迅速，文献报道采用50%Pip/DMF，脱1min，4min条件，但是咱们实验证明在多数状况下，虽然是1min左右反映就超过了20%。
因而普通在末端第一种氨基酸为Pro时候，建议采用2-Cl-Trt树脂合成，由于该树脂巨大空间阻力，可以完全消除该副反映。
这个副反映在BOC方略合成过程中，却可以完全避免，由于BOC在使用TFA脱除后，使氨基以TFA盐形式存在，从而失去了亲核性，不能攻打苄酯键。
图9 DKP反映机理
1.3.3.3．困难序列多肽合成
固相多肽合成中也经常遇到多肽合成失败或合成效率很低问题，这里面重要因素是由于多肽序列引起，由于有些多肽序列在树脂上形成β-折叠，变化了树脂溶胀性能，尚有也许将反映活性位点埋藏在树脂里面，这样使得反映很难进行，当前报道使用重要办法有：
∙使用混合溶剂，DMSO/DMF，6N胍啶/DMF溶液
∙提高反映温度，或采用微波办法
∙使用高离液盐，LiCl，NaClO4等。
∙使用溶胀性能更好PEG-PS树脂，同步减少树脂担载量（0.05-0.2mmol/g）
1.4．合成多肽分析鉴定办法
多肽分析鉴定办法有多肽一级构造，二级构造鉴定，多肽一级构造涉及：
质谱分析，氨基酸构成分析，氨基酸序列分析。
二级构造涉及：
圆二色谱（CD），NMR，X-衍射等办法。
1.4.1．纯度分析
多肽纯度分析，普通都采用HPLC进行分析，选取RP-C18，粒径5μm，孔径300A，4.6×150mm，流动相：
A，0.1%TFA/H2O；B，0.1%TFA/ACN，洗脱梯度，5%B--65%B，时间30min。
也有些多肽，特别是短肽，由于亲水性强，在C18上保存很弱，需要变化条件，这里重要有两种办法：
一种变化分析梯度，可以将起始梯度改为2%，等度或小梯度洗脱；此外一种办法是在流动相中加入强离子对试剂，如七氟丁酸，十八烷基磺酸钠等。
1.4.2．一级构造分析
1.4.2.1．质谱分析
质谱分析目重要是确证分子量，固然采用MS/MS可以某些理解多肽序列信息，但是这个需要比较全数据库作为基本，分析才干比较精确。
由于多肽性质不稳定，需要采用软电离技术，当前多肽分析重要使用了电喷雾（ESI-MS），基质辅助激光解吸（MALDI-MS）。
其中ESI-MS普通会给出多电荷峰，电荷数目和多肽序列上氨基，胍基，咪唑基数目关于，因而，经常给出了双电荷，三电荷等离子峰。
MALDI-MS可以分析蛋白大分子，并且普通状况下很少带多电荷，因而数据直接相应了分子离子峰，容易分析。
此外，普通在分析长肽或蛋白过程中，需要添加NH4，Na，K等离子，提高敏捷度，因此普通在MS中浮现一组峰，分别相应：
（M+H）+，（M+NH4）+，（M+Na）+，（M+K）+。
1.4.2.2．氨基酸构成分析
氨基酸构成分析普通需要产品纯度较高，它可以给出多肽中氨基酸种类，数目。
分析过程一方面通过酸水解破坏肽键，典型酸水解条件是：
真空条件下，110℃，用6M盐酸水解16至72小时。
酸水解虽然很有用，但酸水解条件下不能获得完整氨基酸分析，由于天冬酰胺和谷氨酰胺侧链具有酰胺键，用于切断蛋白质肽键酸也可以将天冬酰胺转换为天冬氨酸，谷氨酰胺转换为谷氨酸。
由于水解温度比较高，色氨酸吲哚环容易被空气氧化，虽然在密封管中，色氨酸吲哚环也几乎都被破坏了。
因而蛋白质色氨酸含量往往是通过它紫外吸取光谱预计，也可以通过碱水解分析色氨酸含量。
半胱氨酸在酸水解中也不能精准测定，要精准测量需要在蛋白质水解之迈进行氧化或羧甲基化，形成衍生物在酸水解之后才干定量。
1.4.2.3．氨基酸序列分析
氨基酸序列分析基本原理是Edman降解，重要涉及耦联、水解、萃取和转换等4个过程。
一方面使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0碱性条件下对蛋白质或多肽进行解决，PITC与肽链N-端氨基酸残基反映，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。
然后PTC-肽用三氟乙酸解决，N-端氨基酸残基肽键被有选取地切断，释放出该氨基酸残基噻唑啉酮苯胺衍生物。
接下来将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反映液中萃取出来，而去掉了一种N-端氨基酸残基肽仍留在溶液中。
萃取出来噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一种稳定苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。
留在溶液中减少了一种氨基酸残基肽再重复进行上述反映过程，整个测序过程当前都是通过测序仪自动进行。
1.4.3．二级构造分析
1.4.3.1．圆二色谱（CD）
圆二色谱是一种特殊吸取谱，它通过测量蛋白质等生物大分子圆二色光谱，从而得到生物大分子二级构造，简朴、快捷，广泛应用在蛋白质折叠，蛋白质构象研究，酶动力学等领域。
圆二色谱紫外区段（190-240nm），重要生色团是肽链，这一波长范畴CD谱包括了生物大分子主链构象信息。
α-螺旋构象CD谱在222nm、208nm处呈负峰，在190nm附近有一正峰。
β-折叠构象CD谱，在217-218nm处有一负峰，在195-198nm处有一强正峰。
无规则卷曲构象CD谱在198nm附近有一负峰，在220nm附近有一小而宽正峰。
1.4.3.2．核磁共振（NMR）
随着二维、三维以及四维NMR应用，分子生物学、计算机解决技术发展，使NMR逐渐成为大分子构造物质分析重要办法之一。
NMR可用于拟定氨基酸序列、分布以及构象。
当前，NMR在分析分子中含少于30个氨基酸小肽时是非常有用，分析成果迅速精确。
1.4.3.3．X-衍射
X-衍射可获得关于化合物晶型直接信息，并且可以判断相对与绝对构型。
∙多肽标记及修饰
当前多肽标记及修饰内容非常多，广泛应用在多肽药物，多肽生物学，多肽抗体以及多肽试剂研究中。
当前应用广泛有：
非放射性核素标记（C13，H2），荧光标记（FAM，FITC），生物素标记，磷酸化修饰等。
2.1．非放射性核素标记
当前在非放射性核素标记中，使用广泛依然是C13，H2，由于其使用安全，放射性小。
当前有比较完全非放射性标记氨基酸，可以按照正常多肽合成办法将标记好氨基酸直接连接到多肽上。
2.2．荧光标记
荧光标记由于没有放射性，实验操作简朴。
因而，当前在生物学研究中荧光标记应用非常广泛，荧光标记办法与荧光试剂构造关于系，对于有游离羧基采用办法与接肽反映相似，也采用HBTU/HOBt/DIEA办法连接。
但是对于FITC标记，需要在连接FITC前，增长一种氨基己酸，避免在切割过程中被TFA切割掉。
2.3．生物素标记
生物素-亲合素系统（biotin-avidinsystem，BAS），是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展一种新型生物反映放大系统。
由于它具备生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析特异性和敏捷度进一步提高。
重要有用于标记多肽氨基生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）和生物素对硝基酚酯（pBNP），其中以BNHS最惯用，固然，也可以直接使用生物素也可以标记，由于其构造上有个游离羧基，采用HBTU/HOBt/DIEA办法缩合，由于生物素溶解度低，使用DMSO/DMF混合溶剂增长溶解度。
2.4．磷酸肽合成
磷酸肽在生命过程中发挥重要作用，磷酸化位置在多肽上Ser，Thr，Tyr。
当前磷酸肽合成普通都采用磷酸化氨基酸，当前使用都是单苄基磷酸化氨基酸，Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。
磷酸化氨基酸连接普通采用HBTU/HOBt/DIEA办法，但是当前采用该办法合成磷酸化也有缺陷，特别是在合成多磷酸化多肽或长肽时候，连接效率低，最后产品纯度很低，对于这种磷酸化多肽，咱们考虑采用后磷酸化办法，其合成过程就是在多肽合成结束后，选取性脱去要标记氨基酸侧链保护基，对于Tyr，Thr可以直接使用侧链不保护氨基酸进行反映，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1%TFA/DCM条件下可以定量脱除。
后磷酸化，采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体，连接到羟基上，随后在过氧酸下氧化生成磷酰基，完毕反映。
∙蛋白构造与功能模仿多肽
多肽在与蛋白受体结合发挥功能时候，总是先折叠出某些特殊构造，多肽类似物合成重要是为了模仿这些构造，保持或提高生物活性，同步也为了变化多肽稳定性，提高其抗酶解能力。
3.1．α-螺旋多肽
α-螺旋是蛋白构造中最为普通一种，但是普通多肽在溶液中大多是无规卷曲，当前使用最多办法是多肽保持α-螺旋构造就是在多肽表面通过共价键将处在α-螺旋构造两个氨基酸连接起来，选取位点（i，i+4或i，i+7），选取化学键涉及：
二硫键，硫醚键，酰胺键，烯烃键（RCM）等办法。
3.1.1．二硫键
二硫键广泛存在与蛋白构造中，对稳定蛋白构造具备非常重要意义，二硫键普通是通过序列中2个Cys巯基，经氧化形成。
形成二硫键办法诸多：
空气氧化法，DMSO氧化法，过氧化氢氧化法等。
二硫键合成过程，可以通过Ellman检测以及HPLC检测办法对其反映进程进行监测。
3.1.2．硫醚键
硫醚键形成可以通过序列中Lys，将溴乙酸连接到Lys侧链氨基上，运用其和巯基特异性反映，反映在缓冲溶液中进行，迅速高效。
3.1.3．酰胺键
多肽内酰胺环肽合成普通是运用Lys，Asp（Glu）选取性保护，在固相上直接环化。
BOC方略中可以采用BOC-Lys（Fmoc），BOC-Asp（OFm），FMOC方略中可以采用FMOC-Lys（Aloc），FMOC-Asp（Allyl）。
对于首尾环肽，还可以先合成保护多肽，然后在液相中环化生成目的多肽。
3.1.4．烯烃键（RCM）
RCM反映是一种过渡金属催化反映，其反映中使用催化剂：
（Cy3P）2Cl2Ru=CHPh，可以催化烯烃环化，过程中脱去一分子乙烯。
图10 固相RCM反映
该反映也可以在固相树脂上直接环化,反映条件：
15-25%（Cy3P）2Cl2Ru=CHPhDCM,60-80℃，24-48h。
3.2．TASP（template-assembledsyntheticpeptide）多肽
瑞士Basel大学化学家初次提出TASP概念，她们运用品有“发夹”构造肽链作为模板，然后将具备α-螺旋构造多肽直接连接到模板上，模仿蛋白质高档构造。
3.3．长肽或蛋白合成
3.3.1．FMOC-tbu片段缩合办法
FMOC-tbu片段缩合办法在合成长肽以及蛋白上面运用非常广泛，其合成过程一方面是合成保护性肽片段，通过纯化后，将几种片段在液相或固相上组装起来。
使用本办法重要注意几种方面：
片段选取，片段合成与纯化，片段缩合办法。
片段选取要考虑到片段连接反映时间长，容易导致消旋，故片段C末端最佳选取Gly，Pro。
合成片段普通需要通过C4，C8等纯化，对于溶解性很差多肽，可以采用硅胶柱层析办法进行纯化。
由于片段分子大，在树脂内移动速度慢，故反映时间普通都很长，并且反映过程中与片段浓度关系很大，溶解时候，尽量提高片段浓度。
对各种条件选取，发现采用DMF为溶剂，DIC/HOBt办法缩合效率最高，消旋也最小。
图11FMOC-tbu片段缩合示意图
3.3.2．自然化学连接（NativeChemicalLigation）
自然化学连接办法长处是可以采用完全脱保护多肽，因而不存在溶解性问题，其反映也是在缓冲水溶液中进行，由于其运用是巯基和硫酯特异性反映，再通过由S到N转变完毕肽键合成。
图13自然化学连接
总之，此
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