PCR引物设计基本思路.docx

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PCR引物设计基本思路

1.根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询

RBS149..153

/gene="eryF"

CDS158..1372

/gene="eryF"

1ggatcccgatcgtgtcggaggaagaggccaagtcgcgccgccccgaccagctgctggtgc

61tgccctggatctaccgcgacgggttcgtcgaacgcgagcaggagttcctcgctggcggcg

121gaaagctgatcttccccctaccccgactggaagtcgtatgacgaccgttcccgatctcga

181aagcgactccttccacgtcgactggtaccgcacctacgccgagctgcgcgagaccgcgcc

241ggtgacgccggtgcgcttcctcggccaggacgcgtggctggtcaccggctacgacgaggc

301gaaggccgcgctgagcgacctgcgcctgagcagcgacccgaagaagaagtacccgggcgt

361ggaggtcgagttcccggcatacctcggtttccccgaggacgtgcggaactacttcgccac

421caacatgggcaccagcgacccgccgacccacacccggctgcgcaagctggtgtcgcagga

481gttcaccgtccgccgcgtggaggcgatgcggccccgcgtcgagcagatcaccgcggagct

541gctcgacgaggtgggcgactccggcgtggtcgacatcgtcgaccgcttcgcccacccgct

601gcccatcaaggtcatctgcgagctgctcggcgtcgacgagaagtaccgcggggagttcgg

661gcggtggagctcggagatcctggtcatggacccggagcgggccgaacagcgcgggcaggc

721ggccagggaggtcgtcaacttcatcctcgacctggtcgagcgccgccgcaccgagcccgg

781cgacgacctgctgtccgcgctgatcagggtccaggacgacgatgacggtcggctcagcgc

841cgacgagctgacctccatcgcgctggtgctgctgctggccggtttcgaggcgtcggtgag

901cctcatcgggatcggcacctacctgctgctcacccacccggaccagctcgcgctggtgcg

961gcgggacccgtcggcgctgcccaacgccgtcgaggagatcctgcgctacatcgctccgcc

1021ggagaccaccacgcgcttcgccgcggaggaggtggagatcggcggtgtcgcgatccccca

1081gtacagcacggtgctggtcgcgaacggcgcggccaaccgcgacccgaagcagttcccgga

1141cccccaccgcttcgacgtcacccgcgacacccgcggccacctgtcgttcgggcagggcat

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1621gccctgttcgggcacagcatgggcgcgttgatcgcctacgagacggcgcgcaggctcgaa

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1741cacgagcgccgcaccgacctgcccggcgacgacggtctggtggacgagctgcgccggctc

1801ggcaccagcgaggcggcgctggccgacgaggccctgctcgccatgtcgctgccggtgctg

1861cgcgccgactaccgcgtgctgcgctcctacgcctgggcggacggaccaccgctgcgggcc

1921ggcatcaccgcgctgtgcggcgacgccgacccgctgaccgcgaccggggacgccgagcgc

1981tggttgcagcactcggtcatccccggccggaccaggaccttccccggcgggcacttctac

2041ctgggtgaacaggtcaccgaggtggccggtgccgtgcgccgggacctgctacgcgccggg

2101cttgcgggctgaggcgatcacgaagtcgagcgcgggcagctcgcccttcatgcccgagtc

2161gctggtcagcgaccgcttgacctggctgtagaagagcctgctcacgctcttcttgaacga

2221ctcgtcctgcaggcacctggctg

2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。

所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。

这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。

并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点（generuner分析）。

3.初步确定设计的引物长度。

一般为15～30bp，引物过短会影响到扩增的特异性，过长会影响扩增速率。

如果扩增产物≤500bp，引物长度为16～18bp即可。

若扩增产物为4～5kb，引物最好不要少于24bp。

引物3’末端应含有所研究基因特异序列中的17～30bp。

4.5正向引物的设计：

4.1酶切位点的位置选择。

一般情况下都需要在引物的5’，3’端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。

A：

扩增的DNA用于表达时：

（1）自身有启动子。

如：

LOCUSVITVHBA689bpDNAlinearBCT26-APR-1993

DEFINITIONVitreoscillasp.hemoglobin（VHb）gene,partialcds.

ACCESSIONM30794M31721X13516

VERSIONM30794.1GI:

155319

KEYWORDShemoglobin;promoterregion.

SOURCEVitreoscillasp.

ORGANISMVitreoscillasp.

Bacteria;Proteobacteria;Betaproteobacteria;Neisseriales;

Neisseriaceae;Vitreoscilla.

REFERENCE1（bases42to689）

AUTHORSKhosla,C.andBailey,J.E.

TITLETheVitreoscillahemoglobingene:

molecularcloning,nucleotide

sequenceandgeneticexpressioninEscherichiacoli

JOURNALMol.Gen.Genet.214

（1）,158-161（1988）

MEDLINE89143453

PUBMED3067078

REFERENCE2（bases1to210）

AUTHORSKhosla,C.andBailey,J.E.

TITLECharacterizationoftheoxygen-dependentpromoterofthe

VitreoscillahemoglobingeneinEscherichiacoli

JOURNALJ.Bacteriol.171,5995-6004（1989）

COMMENTOriginalsourcetext:

Vitreoscillasp.DNA.

SWISS-PROT;P04252;BAHG$VITSP.

FEATURESLocation/Qualifiers

source1..689

/organism="Vitreoscillasp."

/mol_type="genomicDNA"

/db_xref="taxon:

60"

misc_signal33..40

/note="promoter2"

-35_signal55..61

-10_signal73..79

misc_signal86..92

/note="promoter1"

RBS130..133

/note="putativeribosomebindingsite;putative"

CDS142..582

/note="hemoglobin"

/codon_start=1

/transl_table=11

/protein_id="AAA27585.1"

/db_xref="GI:

155320"

/translation="MLDQQTINIIKATVPVLKEHGVTITTTFYKNLFAKHPEVRPLFD

MGRQESLEQPKALAMTVLAAAQNIENLPAILPAVKKIAVKHCQAGVAAAHYPIVGQEL

LGAIKEVLGDAATDDILDAWGKAYGVIADVFIQVEADLYAQAVE"

ORIGIN

1aagcttacaggacgctggggttaaaagtatttgagttttgatgtggattaagttttaaga

61ggcaataaaggtgctgctacaccatactgatgtatggcaaaaccataataaccatactga

121atgaacttaaggaagaccctcatgttagaccagcaaaccattaacatcatcaaagccact

181gttcctgtattgaaggagcatggcgttaccattaccacgactttttataaaaacttgttt

241gccaaacaccctgaagtacgtcctttgtttgatatgggtcgccaagaatctttggagcag

301cctaaggctttggcgatgacggtattggcggcagcgcaaaacattgaaaatttgccagct

361attttgcctgcggtcaaaaaaattgcagtcaaacattgtcaagcaggcgtggcagcagcg

421cattatccgattgtcggtcaagaattgttgggtgcgattaaagaagtattgggcgatgcc

481gcaaccgatgacattttggacgcgtggggcaaggcttatggcgtgattgcagatgtgttt

541attcaagtggaagcagatttgtacgctcaagcggttgaataaagtttcaggccgctttca

601ggacataaaaaacgcaccataaggtggtctttttacgtctgatatttacacagcagtttg

661gctgttgccaaaacttgggacaaatattg

1扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启动子前面。

2可在所扩增的DNA序列的启动子前寻找是否有该酶切位点，若有则直接利用该酶切位点进行扩增；若无可寻找与其基本相似的位点进行扩增。

（2）扩增片段里自身无启动子。

因为在5’端增加的酶切位点（所选的酶切位点与启动子的酶切位点相同）中必须含起始密码子，如NcoI（CCATGG），NdeI（CATATG），设计引物时，酶切位点的起始密码子要和DNA序列的起始密码子重叠。

如上例：

若添加的酶切位点为NdeI，引物的5’端酶切位点应设计位5’—CATATGTTAGAC—3’；若添加的酶切位点为NcoI，因为其位点ATG后的G与DNA起始密码子后的T不配对，在处理这个问题上有两种方法：

一种是用G取代T，其缺点是破坏了阅读框，可能对表达会有影响；另外一种方法是将酶切位点上的G改为T，相应的酶切位点应改为ACATGT，并查询是否有该酶存在，若有，可以直接利用，因为同尾酶也可连接。

若无，可用平末端连接。

B：

若扩增的DNA用于阻断。

如eryF：