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动物医学论文

【动物医学论文】探讨防治应激条件下大鼠哮喘的作用

［论文摘要］目的：

探讨心理因素对哮喘发病的影响和调肝法调节应激、防治哮喘的作用机制。

方法：

用卵蛋白加束缚应激刺激建立应激条件下哮喘大鼠模型，采用放射免疫分析法、酶联免疫吸附法、原位杂交、免疫组化、光镜及电镜等方法，检测各组大鼠血浆皮质酮、白细胞介素4、干扰素γ、海马糖皮质激素受体mRNA和下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素（adrenocorticotropichormonecorticoliberin,CRH）阳性神经元，并观察肺和海马组织形态学的变化。

结果：

疏肝理肺方可明显降低血浆皮质酮水平，升高血浆干扰素γ，降低血浆白细胞介素4，减少下丘脑室旁核CRH阳性神经元，上调海马CA3区糖皮质激素受体mRNA的表达，减轻海马神经元的损伤，并可明显减轻应激条件下哮喘大鼠肺组织的病理改变。

结论：

疏肝理肺方通过抑制应激条件下哮喘大鼠下丘脑垂体肾上腺皮质轴功能的亢进及调节免疫系统的功能，从而起到防治哮喘的作用。

［论文关键词］应激;哮喘;疏肝理肺法

　　ProtectiveandtherapeuticeffectsofShuganLifeiRecipeonratswithasthmaunderstressandthemechanisms

　　ABSTRACT Objective:

Toexploretheinfluenceofpsychologicalfactoronasthma,theprotectiveandtherapeuticeffectsofShuganLifeiRecipeonratswithasthmaunderstressandthemechanisms.Methods:

Allergyandstressinducedasthmamodelswereestablishedinratsbygivingovalbuminandrestrainingstress.Radioimmunoassay,enzymelinkedimmunosorbentassay,insituhybridizationandimmunohistrochemicalmethodwereusedtodetectplasmacorticosterone,IL4,IFNγ,expressionofglucocorticoidreceptor（GR）mRNAinhippocampusandadrenocorticotropichormonecorticoliberin（CRH）positveneuroninhypothalamus.Opticalandelectronmicroscopeswereusedtoobservethemorphologicalchangesofpulmonaryhilarandhippocampaltissues.Results:

ShuganLifeiRecipe（SGLFR）couldreduceplasmacorticosterone,decreaseCRHpositiveneuronsinparaventricularnucleusofhypothalamus,upregulatetheexpressionofGRmRNAinhippocampusandreducetheinjuryofhippocampalneuron.SGLFRhadcertaininhibitiveeffectonhyperfunctionofhypothalamopituitaryadrenalcortex（HPA）axisinratswithasthmaunderstressandcouldalsorelievethepathologicalchangesofthepulmonaryhilartissue.ThelevelofplasmaIFNγwasincreasedwhilethelevelofplasmaIL4wasdecreasedinSGLFRtreatedgroup.Conclusion:

ThemechanismofSGLFRintreatingtheratswithasthmaunderstressisprobablytoregulatethehyperfunctionofHPAaxisandthedisorderofimmuosystem.

　　KEYWORDS stress;asthma;dispersingstagnatedliverqiandregulatinglungqi

　　支气管哮喘是一种多病因疾病，发病机制十分复杂，严重危害人类的健康。

其发病受生物、心理和社会三方面因素的影响，其中精神心理因素在哮喘的发生、发展和转归中起着重要的作用。

现代社会工作和生活节奏日益加快，竞争日趋激烈，机体长期处于紧张状态下，通过影响神经内分泌系统继而干扰机体的免疫功能，从而诱发或加重哮喘。

　　中医学很早就认识到不良的环境或精神刺激与躯体疾病的发生、发展有密切的关系。

肝主疏泄，调畅气机，在心理应激调节中起着决定性的作用。

现代医学认为：

任何形式的应激都可导致神经内分泌功能紊乱，造成免疫功能障碍，使机体对各种感染性疾病呈易感状态。

大量研究表明：

肝主疏泄功能与现代医学的神经内分泌免疫网络密切相关，调肝法有调整神经内分泌免疫功能失调的作用。

本实验运用疏肝理肺方治疗应激条件下的哮喘大鼠，探讨心理因素对哮喘发病的影响以及调肝法调节应激、防治哮喘的作用机制。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物分组及模型建立 SD雄性大鼠56只，体质量（190±20）g，随机分为7组：

正常组、哮喘组、应激组、哮喘应激组、地塞米松组、理肺组和疏肝理肺组，每组8只。

哮喘组、哮喘应激组、地塞米松组、理肺组和疏肝理肺组大鼠分别予以腹腔注射抗原液（含卵蛋白、氢氧化铝干粉和灭活百日咳杆菌）1ml致敏；正常组和应激组大鼠则分别予以腹腔注射等量生理盐水。

致敏后第8天起，应激组、哮喘应激组、地塞米松组、理肺组和疏肝理肺组大鼠予以双后肢立式固定，行束缚应激刺激，4h/d，共3周；致敏后第8天起，哮喘组、哮喘应激组、地塞米松组、理肺组和疏肝理肺组大鼠另分别予以2%卵蛋白雾化吸入，3min/d，共2周。

　　1.2药物及给药方法 理肺方（LifeiRecipe,LFR）即小青龙汤，由麻黄9g、桂枝9g、炙甘草9g、细辛9g、干姜9g、半夏9g、五味子9g和白芍9g组成；疏肝理肺方（ShuganLifeiRecipe,SGLFR）即小青龙汤合四逆散，由麻黄9g、桂枝9g、炙甘草9g、细辛9g、干姜9g、半夏9g、五味子9g、白芍9g、柴胡9g和炙枳实9g组成。

理肺方和疏肝理肺方用水煎制后滤液，制成浓缩口服液，分别含生药2.8g/ml和3.6g/ml。

地塞米松（0.75mg/片）于灌胃前用生理盐水配制成混悬液，浓度为0.1mg/ml。

致敏后第8天起，地塞米松组、理肺组和疏肝理肺组大鼠分别予以地塞米松混悬液10ml/kg、理肺方口服液10ml/kg和疏肝理肺方口服液10ml/kg灌胃；正常组、应激组、哮喘组和哮喘应激组大鼠则分别予以等量生理盐水灌胃。

共给药3周。

　　1.3动物处理及取材 实验第4周末，用25%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，抽取腹主动脉血立即注入抗凝管中，3000r/min离心15min，分离血浆，分装保存于－70℃低温冰箱中待测。

腹主动脉抽血后立即灌流大鼠，每组选取灌流成功的大鼠3只，取肺组织备光镜检查及视交叉至乳头体的脑组织备光镜、电镜、免疫组化和原位杂交检查。

　　1.4血浆皮质酮的测定血浆皮质酮放射免疫检测试剂盒，由晶美生物工程有限公司提供。

根据标记的与未标记的皮质酮抗原竞争性结合其特异性抗体的原理进行检测。

反应系统中123I皮质酮抗原抗体复合物的形成量受样品中未标记的皮质酮抗原量的影响，即样品中未标记皮质酮的含量越高，则123I皮质酮抗原抗体复合物的形成就越少，通过测定抗原抗体复合物的放射性，计算相关参数，绘制标准曲线，直接读出样品中皮质酮的含量。

实验步骤严格按试剂盒说明书操作。

　　1.5海马糖皮质激素受体mRNA的检测 海马糖皮质激素受体（glucocorticoidreceptor，GR）mRNA原位杂交试剂盒，由博士德生物工程有限公司提供，采用漂浮法检测。

取视交叉至乳头体的脑组织，行快速连续冰冻切片，检测步骤严格按试剂盒说明书进行，均为无菌操作。

采用IMS细胞图像分析系统分析结果。

　　1.6下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素阳性神经元的检测 下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素（adrenocorticotropichormonecorticoliberin,CRH）阳性神经元采用SABC免疫组化试剂盒进行检测，试剂盒由博士德生物工程有限公司提供。

取视交叉至乳头体的脑组织，行快速连续冰冻切片，检测步骤严格按试剂盒说明书进行。

采用IMS细胞图像分析系统分析结果。

　　1.7白细胞介素4和干扰素γ的检测 白细胞介素4（interleukin4,IL4）和干扰素γ（interferonγ,IFNγ）酶联免疫试剂盒，均由晶美生物工程有限公司提供。

　　1.8形态学观察

　　1.8.1大鼠海马光镜形态学观察 取大鼠视交叉至乳头体的脑组织，常规光镜下观察。

　　1.8.2大鼠海马透射电镜形态学观察 依据鼠脑立体定位图谱，取海马矢状切面1mm3组织块，常规电镜下观察。

　　1.8.3大鼠肺组织光镜形态学观察 取大鼠肺门组织，常规光镜下观察。

　　1.9统计学方法 采用SPSS10.0软件进行统计学分析。

计量资料均数用x±s表示，采用单因素方差分析和q检验。

　　2结果

　　2.1疏肝理肺方对应激条件下哮喘大鼠血浆皮质酮的影响 应激组与正常组比较，血浆皮质酮水平明显升高（P<0.01）；哮喘应激组与哮喘组比较，血浆皮质酮水平亦有明显升高（P<0.01）；疏肝理肺组与理肺组比较，血浆皮质酮水平明显降低（P<0.01）。

见表1。

　　表1 各组大鼠血浆皮质酮水平比较（略）

　　Tab1 Comparisonofplasmacorticosteroneindifferentgroups

　　*P<0.05,**P<0.01,vsnormalcontrolgroup;△△P<0.01,vsallergyinducedasthmamodelgroup;▲▲P<0.01,vsallergyandstressinducedasthmamodelgroup;□□P<0.01,vsLFRtreatedgroup;■P<0.05,■■P<0.01,vsdexamethasonetreatedgroup

　　2.2疏肝理肺方对应激条件下哮喘大鼠海马GRmRNA和下丘脑CRH阳性神经元的影响 应激组与正常组比较，海马GRmRNA表达明显减少（P<0.01），下丘脑CRH阳性神经元的数目明显增加（P<0.01）；哮喘应激组与哮喘组比较，海马GRmRNA表达明显减少（P<0.01），下丘脑CRH阳性神经元的数目明显增加（P<0.01）；疏肝理肺组与理肺组比较，海马GRmRNA表达明显增加（P<0.01），下丘脑CRH阳性神经元的数目明显减