神经元的高尔基染色法protocol_精品文档.pdf

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神经元的高尔基染色方法（神经元的高尔基染色方法（protocol）针对神经元的针对神经元的Golgi-Cox染色方案和处理染色方案和处理制作人：

制作人：

TraceyWheeler（GeorgeMasonUnivesity）1.配置高尔基溶液（1L容量）A溶液：

5%重铬酸钾溶液重铬酸钾5g+蒸馏水200ml（最好在通风的情况下，用玻璃棒在烧杯中搅拌均匀）。

B溶液：

5%升汞升汞10g+蒸馏水200ml（最好在通风的条件下，用玻璃棒在烧杯中不断搅拌，适合加热直至溶解。

C溶液：

5%铬酸钾溶液铬酸钾8g+蒸馏水160ml（最好在通风情况下，用玻璃棒在烧杯中搅拌均匀）。

将A溶液和B溶液倒入500ml烧杯中搅拌均匀，C溶液倒入1000ml烧杯中，用400ml蒸馏水稀释，在不断搅拌中缓慢将A、B混合溶液倒入C溶液中，保存在带有棉花塞子的玻璃瓶中熟化5天（黑暗中）。

备注：

根据下面的比率以及需要配置溶液的量加以配置5体积的5%重铬酸钾5体积的5%升汞4体积的5%铬酸钾10体积的蒸馏水加入C溶液中2.将高尔基同业转入小玻璃瓶中用塑料吸管从大玻璃瓶中吸取高尔基溶液（尽量避免吸入红色沉淀物）放入小玻璃瓶中，大约为整瓶体积的3/4（剩下的容积足够容纳一只动物大脑）。

3.用盐水注射技术处死动物动物麻醉后，绑在空饲养盒子上（可以让血流入盒子中），打开胸腔暴露心脏，将0.9%盐水60ml注入右侧心室底部（即动物的左心室），剪开左侧，心室底部（即动物的右心室），缓慢注入盐水，直至左侧的心室的血液全部消除（可能需要注射三次），断头取脑，放入配置好的高尔基溶液中，在黑暗中储存14天，2天后更换新鲜高尔基溶液。

4.将脑组织转入蔗糖溶液中蔗糖溶液：

300g蔗糖+1000ml蒸馏水（用玻璃棒在烧杯中不断搅拌，适当加热直至溶解），然后放入冰箱中冷藏（一旦变冷即可使用）倒掉高尔基溶液，将脑组织在滤纸上轻轻吸干，用蒸馏水冲洗广口瓶，放入3/4蔗糖溶液（有足够空间容纳脑组织），然后将脑组织放入广口瓶中（脑组织会漂浮起来），放入冰箱储存。

脑组织一旦下沉，就可以准备切片。

5.使用振动切片机切片将刀片在二甲苯中浸泡5min去除油脂后（在通风条件下），取出擦干。

配制6%的蔗糖溶液（蔗糖6g+100ml蒸馏水），在室温和低于室温下保存。

将6%蔗糖溶液倒入振动切片机的储存室直至刀片被覆盖。

将脑组织（直到整个大脑的1/2）用强力胶固定在振动切片机的平台上（需要57min或更长时间，以确保组织在切片上被粘牢）。

然后将粘有脑组织的平台插入储存室。

将切片机的速度和幅度均调至中点（可根据不同的仪器和安全要求进行操作），在200m或需要的厚度处切片（超过400m的切片分析有困难）。

用小画笔将切片移动到明胶化的玻璃片上。

用石蜡膜覆盖组织。

玻片比较平的一面用吸水海绵覆盖，石蜡膜一侧也用吸水海绵覆盖，用手掌轻轻压，尽量不要移动位置（目的是将组织切片压在玻片的明胶上，在染色过程中能够粘附在玻片上），取掉海绵纸将玻片在湿润的环境中。

6.染色配置新鲜的溶液（足够覆盖所有玻片）蒸馏水（3体积）氨水（1体积，在通风环境下）柯达固定液（1体积，在通风条件下，黑暗中）50%乙醇（1体积）70%乙醇（1体积）95%乙醇（1体积）100%乙醇（3体积）CXA溶液（1体积）柯达固定液：

将所有成分放在烧杯中，按顺序混合（避光）加1010ml蒸馏水，加251ml柯达固定液A，加28ml柯达固定液B，加2020ml蒸馏水。

（可根据需要每次配1/2或1/3）CXA溶液：

1000ml氯仿+1000ml二甲苯+1000ml乙醇（可根据需要每次配1/2或1/3，必要的话揭掉玻片上的石蜡膜，将玻片放入玻璃托盘通过以下环节染色用蒸馏水冲洗1min氢氧化铵溶液中浸泡30min（黑暗中）用蒸馏水冲洗1min柯达固定液浸泡30min（黑暗中）用蒸馏水冲洗1min（只要在水中就可以开灯）用50%乙醇脱水1min用70%乙醇脱水1min用95%乙醇脱水1min用100%乙醇脱水5min用100%乙醇脱水5min用100%乙醇脱水5min在CXA溶液中放置15min（在通风条件下，玻片保存在CXA溶液中，当盖片时，依次取出玻片）备注：

经常换手套，在CXA溶液中手套易破裂7.用中性树胶盖玻片，然后晾干如果可能所有的玻片都应该在通风环境下盖片，玻片应该在通风情况下平放保存24h，依次从CXA溶液中取出玻片，用玻璃滴管在组织上滴两滴中性树胶（切片很快就变干，不要提前从CXA溶液中取出玻片，在空气中的时间不要超过20秒）。

将盖玻片在切片上，尽量避免产生气泡。

备注：

中性树胶太少组织会变干，太多会使盖玻片滑动。

将玻片放在吸水纸上（通常在鼠笼中使用白色的托盘衬垫），让玻片平放24h，然后玻片放在盒中保存（盒一定要打开）6个月才能进行分析。