ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用_精品文档.pdf
《ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用_精品文档.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用_精品文档.pdf（3页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
收稿日期：
20080919作者简介：
白树猛（1983），男，硕士，主要研究方向为海洋微生物学。
ITS序列分析在真菌分类鉴定和分子检测中的应用白树猛，田黎（青岛科技大学生物系，山东青岛266042）摘要：
笔者介绍了ITS序列结构特点，综述了ITS序列在植物病原真菌分类鉴定和分子检测中的应用，并对其应用前景进行了展望。
关键词：
ITS；分类鉴定；分子检测中图分类号：
Q949.32；Q522.6文献标识码：
A文章顺序编号：
1672-5190（2009）01-0052-02ApplicationofITSSequencesinClassificationandIdentificationandMolecularTestofFungiBAIShu-meng,etal（BiologyDepartment,QingdaoUniversityofScience&Technology,Qingdao266042,China）Abstract：
ThepaperintroducedITSsequencestructuralcharacteristic,summarizedtheapplicationofITSsequencesintheidentifica-tionandmoleculartestofplantpathogenicfungus.Anditsappliedprospectwasputforward.Keywords：
ITS;classificationandidentification;moleculartest真菌核糖体基因转录间隔区（internaltranscribedspacerITS），又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA（rDNA）上18S和28S基因之间的区域片段，主要包括内转录间隔区1（ITS1）、5.8SrDNA、内转录间隔区2（ITS2），其两侧分别是18SRNA基因和28SRNA基因。
虽然ITS1和ITS2是核糖体转录单位中的一部分，但这些序列并不转录成RNA，它们只是在核糖体RNA成熟过程中起着重要作用1。
rDNA在种内由于基因的流动而经常表现出很高的同源性，在种间则保持着各种程度的变异。
变异的多少能够反映生物进化上属内种间亲缘关系的远近。
最常见的变异是ITS上的单个碱基的替换，其次是碱基的插入或缺失。
与核糖体DNA中的18S、5.8S和28S的基因组序列相比较，ITS1和ITS2作为非编码区，承受的进化选择压力较小，相对变化较大，在种间表现出较高的差异，可以为研究真菌的分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息。
Gonzalea于1990年提出利用ITS作为全新的分子标记，由于该分子标记技术具有快速、准确、微量、灵敏度高、程序简单等优点，现已广泛应用于真菌的分类鉴定、检测和病害诊断2-3。
1ITS在真菌分类、鉴定方面的应用自White等1990年首先设计ITS引物对真菌核内核糖体RNA基因进行扩增以来，ITS序列分析技术在真菌分类、鉴定的研究中应用越来越广泛4。
传统真菌的分类、鉴定主要是基于营养体和子实体的形态学特征并结合其生理生化性状的描述。
但是真菌形态特征容易受到培养条件和其他因素的影响，而且许多子实体类型经常难以获得，传统的分类方法不能满足某些菌种的分类要求。
由于ITS的序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，此外ITS序列片段较小，人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，易于分析，目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中5。
唐建辉等6根据核糖体转录间隔区ITS的通用引物（ITS1/ITS4），扩增西瓜炭疽病菌的ITS区段，并将其序列和GeneBank中登录的炭疽属24个种的ITS序列进行比较，分别建立ITS1、ITS2聚类分析图，探讨炭疽属的系统发育情况。
陈玉玺7等探索镰刀菌菌株间的系统发育关系。
通过对分离到的镰刀菌菌株进行ITS序列测定，采用邻接法构建相关菌株的ITS序列系统发育树。
结果表明，各分支内序列相似性较高，而不同分支间菌株序列相似性较低。
陈永青8等采用随机扩增多态性DNA技术和核糖体ITS序列分析，对22种拟茎点霉共34个菌株进行了系统发育研究，结果表明，两种技术用于拟茎点霉的亲缘关系分析和种类鉴定是可行的。
杨雅云9等对马铃薯及番茄晚疫病菌的核糖体DNA的ITS区段序列分析表明，相似的序列使得生物学特性也很相似，从而确定它们的亲缘关系也就近。
Karen等10对l7属44种外生菌根菌rDNA上的ITS多样性进行了研究，证实了ITS区域种间多样性较高，而种内多样性较低。
Pritsch等11系统研究了赤杨根系16种不同形态类型的外生菌根ITS的多态性，并与采集于3个赤杨林地的28种外生菌根菌的子实体ITS多态性进行了比较研究。
国外这方?
656-663.王红祥.2008.脂肪基质干细胞研究进展J.国际病理科学与临床杂志，28
（2）：
170-173.严杨钵.2008.骨髓间充质干细胞研究进展J.中外健康文摘（医药学刊），5
（1）：
174.ThorpeSD,BuckleyCT,VinardellT,etal.2008.Dynamiccompres-sioncaninhibitchondrogenesisofmesenchymalstemcellsJ.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,377:
458-462.徐蕴.2007.黏附分子在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达及其意义D.济南：
山东大学.Rui-Zhen,Ji-ChangWang,Song-HuaHuang,etal.2008.AngiotensinIIinducevascularendothelialgrowthfactorsynthesisinmsenchymalstemcellsJ.ExperimentalCellresearch,315:
10-15.马良龙，黄惠民，蒋祖明，等.2006.内皮祖细胞定向分化平滑肌细胞的实验研究J.上海交通大学学报，26（8）：
865-869.康永刚，廖云琼.2008.动物遗传繁育进展综述J.现代农业科技，（8）：
175-176.李志勇.2003.细胞工程M.北京：
科学出版社，141.杨丽芬，王清华，韩芬霞，等.2006.哺乳动物胚胎干细胞分离与培养的研究进展J.安徽农业科学，34（12）：
2736-2737.AnimalHusbandryandFeedScience畜牧与饲料科学2009，30
（1）:
52-53面的研究起步较早，发展迅速，而且研究的范围比较广泛，主要集中在黑粉菌12、疫霉菌13、轮枝菌14等植物病原菌的分类和系统发育研究上。
在国内，虽然起步较晚，但在西瓜炭疽病菌15-16、辣椒疫病菌17、大丽轮枝菌18等植物病原菌的系统发育研究上已取得较大的进展19。
对分离到的未知菌种也可通过ITS进行快速鉴定。
Am-icucci等20分析了块菌属真菌ITS区段的DNA序列，设计出块菌的特异性引物，该特异性引物能对块菌属真菌的ITS区段进行专一性扩增。
利用该引物对与块菌形态相似的未知菌株进行扩增，通过扩增结果，就推断出菌株的确切种类。
黄学顺等21对栀子上存在的拟盘多毛孢属真菌引致的叶斑病进行了研究。
采用通用引物ITS1和ITS4对菌株的基因组DNA扩增测序，将菌株的ITS序列进行同源性比较，发现该病原菌的ITS与拟盘多毛孢属（Pestalotiopsissteyaert）真菌的ITS高度相似；对菌株的ITS序列分析发现，该菌株与Pgracilis完全相同，由此推定它属于Pgracilis。
把待测真菌ITS区段的DNA扩增出来，并测出其序列，依据ITS区段的DNA序列进行分子鉴定是一种很精确的对未知菌种进行鉴定的方法。
2ITS在真菌分子检测中的应用目前，关于真菌分子检测的研究主要是针对致病真菌进行的。
传统病原真菌的检测主要基于形态学特征、致病性测定等。
但是这种方法耗时长、程序繁琐，不宜从发病初期的植株中分离鉴定病原菌，难以做到对病害的早期检测。
随着生物学的发展，很多生物技术应用于检测领域，如酶联免疫荧光技术。
但是该方法利用多克隆抗体进行检测，特异性不强，实际应用中存在漏检现象22。
近年来，利用PCR扩增病原真菌核糖体ITS基因片段进行病原菌检测得到了很大发展。
由于核糖体基因ITS序列在真菌种间的高度变异和种内的稳定性，为病原物的分子检测提供了理想的靶序列。
由于该方法快速、准确和简便，越来越受到重视。
王立安等23依据大豆疫霉ITS特有序列设计PCR引物，并对引物的特异性进行了验证，对以该引物为基础的大豆疫霉的分子检测进行研究，结果表明，以该引物为基础的PCR检测方法可以直接对大豆疫霉进行检测应用。
杨佩文等24应用真菌核糖体基因ITS区段通用引物ITS1和ITS4，对十字花科蔬菜根肿病菌rDNA进行PCR扩增、测序分析和特异引物的设计，获得根肿菌一特异性分子片段并对不同寄主植物进行了检测，而参试的烟草根结线虫、马铃薯癌肿病菌、烟草黑胫病菌以及健康对照和无模板DNA对照则均未扩增到该特异片段。
唐建辉等25根据GeneBank中西瓜炭疽病菌（Col-letotrichumorbiculare）的ITS序列，设计出其特异性引物，进一步利用RAPD随机引物扩增西瓜炭疽菌，设计出1对SCAR引物，利用上述2对引物组成双重PCR检测体系，快速鉴定Or-biculare，并且能够直接在植物组织中将西瓜炭疽菌Orbiculare检测出来。
邢红梅等26在红掌炭疽病的病原菌胶胞炭疽菌的分子检测中。
根据GeneBank中炭疽属不同种的ITS序列差异，设计了胶胞炭疽的特异性引物E1/E2，由此建立的PCR检测体系可以从38个胶胞炭疽菌株中扩增得到329bp的特异性条带，而扩增其他近似或相关菌株时没有相应的特异性条带。
引物能从土壤中直接检测到炭疽菌的繁殖体，灵敏度达到200个分生孢子/g土。
进一步利用该检测体系对携带病原菌的灌溉水、发病组织进行检测，均能快速稳定地检测出病原菌。
目前，利用ITS分子标记技术进行分子检测已经广泛应用于炭疽病菌、大丽轮枝菌、黑斑病菌27、大豆疫霉菌等真菌分子检测中。
3前景与展望利用ITS序列对真菌进行鉴定和分子检测，弥补了传统鉴定和检测方法的不足，具有广阔的应用前景。
ITS区域在不同菌株间存在丰富的变异。
对ITS区进行序列分析不仅丰富了真核生物核糖体基因ITS的序列信息，为病原菌的分类鉴定及系统发育等研究提供了十分重要的依据，而且为建立病原菌的分子监测与疫病的快速诊断技术奠定了基础，对植物病害的防治具有一定意义。
随着科学家的研究深入，对真菌的ITS分子检测已经应用到动物致病菌的范围。
彭慧等28采用PCR-RFLP方法对因眼外伤摘除的眼球活组织中培养分离出的一株形态特异的尖端赛多孢子菌的ITS序列进行了分析。
结果发现，形态特异的尖端赛多孢子菌与标准株及其他同种菌株具有相同的酶切图谱，从而证实该标准菌株的ITS序列酶切图谱可供快速、准确地鉴定尖端赛多孢子菌。
王英等29采用2对内转录间隔区ITS的种特异性引物和通用引物对念珠菌悬浮液进行扩增。
结果发现，采用通用引物结合快速检测法可快速、简便、特异、敏感地检测出念珠菌，并能同时鉴定到种，这对念珠菌病的早期诊断和治疗有潜在的应用价值。
ITS这一全新的分子标记技术以其快速、准确、灵敏度高等优点已广泛应用于病原菌的分类鉴定和检测中。
利用分子检测技术对病原真菌进行分类鉴定，结合传统形态学、生物学方法，可以对病原菌给予准确的分类和检测，从而使对真菌分析结果的处理更加准确。
随着ITS分子标记技术的不断研究，真菌的分子检测技术将会应用到越来越广泛的领域，对于真菌污染的早期检测也会更加成熟精确。
参考文献：
12345678910匡治州，许杨.核糖体rDNAITS序列在真菌学研究中的应用J.生命的化学，
升级会员 