反向PCR法扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列_精品文档.pdf

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中国抗生素杂志2008年2月第33卷第2期文章编号：

10018689（2008）02-0111-03反向PCR法扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列张宏梅1石磊2李琳2（1广东工业大学轻化工学院。

广州510006；2华南理工大学食品与生物工程学院，广州510641）摘要：

目的第一类整合子在介导细菌耐药中起重要作用。

本研究采用反向PCR方法对第一类整合子旁翼序列进行分析。

方法以具有典型第一类整合子结构的茨昂威沙门菌（S如hongwe）S191为研究对象，分别用EcoRV和HindIII两种限制性内切酶对基因组DNA进行酶切。

并对酶切产物进行自身环化，通过设计第一类整合酶基因的反向引物来扩增第一类整合子的旁翼序列。

结果分别扩增得到1500和6000bp左右大小的第一类整合子旁翼序列。

结论进一步明确了第一类整合子的结构，并为第一类整合子调控因子的分析和克隆奠定研究基础。

关键词：

反向PCR；整合子；整合酶中图分类号：

R3782+2文献标识码：

A。

AmplificationofneighborDNAsequenceofclass1integronusingreversePCRZhangHong-meil，ShiLeizandLiLin2（1DepartmentofFoodandBiologicalEngineefing，GuangdongUniversityoftechnology，Guan屏hou510006；2CofiegeofFoodandBiologicalEIlgineefing，SouthChinaUniversityofTehnologyG呦gzlOU510641）ABSTRACTObjectiveTheneighborDNAofclass1integronwasinvestigatedusingreversePCRMethodIntegronpositiveStshiongweS191wasthesampleChromosomalDNAofStshiongweS191wasdigestedbyHind111orEcoRVandwaseyclizateditselfInverseprimersweredesignedforamplificationofclass1integraseResultAmpliconsof1，500bpand6，000bpwereobtainedConclusionThestructureofclass1integronWasdemonstratedwellandtheexperimentalresultswerealsolaidafoundationforcontrollingtheexpressionofantibioticresistanceamongbacteriaKEYWORDSReversePCR；Integron；Integrase整合子对细菌耐药性的介导作用，已经引起研究人员的广泛注意，尤其第一类整合子在耐药菌中分布最广泛，占有重要地位。

在以往研究中，对沙门菌第一类整合酶基因阳性菌株的指纹图谱及其检测方法都已有探讨fI引，但是对第一类整合酶基因及耐药基因盒的调控序列研究报道却极少。

现已知，一个基因的表达在很大程度上是由它的旁侧序列调控的，克隆基因的旁侧序列已经成为分子生物学研究中的常规工作之一。

在测定已知基因片段的旁测基因序列方法上，常用的有染色体DNA步移、锚定引物PCR、加人衔接头等方法”。

l，其中应用染色体DNA步移的方法以其准确性高而常用。

反向PCR技术可以对一个已知序列DNA的两侧未知序列进行扩增和研究，也称染色体步移。

该方法常用于检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，建立基因组步移文库及研究基因的上游调控元件，在分子生物学研究中有广泛应用。

本文以第一类整合子阳性菌株茨昂威沙门菌（Stshiongwe）S191为研究对象，采用反向PCR方法扩增第一类整合子的旁翼序列。

1材料和方法11菌株茨昂威沙门菌S191由广州市东山卫生防疫站提供。

霍乱弧菌（驴cholerae）Ol群SK10第一类整合子阳性对照菌株，大肠埃希菌（Ecoli）C600第一类整合收稿日期：

20071017基金项目：

国家自然科学基金（项目批准号：

20707003）。

作者简介：

张宏梅，女，生于1975年，讲师。

通讯作者。

Email：

leishiscuteducn万方数据反向PCR法扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列张宏梅等子阴性对照菌株，日本大阪府立大学国际防疫学研究室惠赠。

12基因组DNA的提取对茨昂威沙门菌S191基因组DNA为模板DNA，参照革兰阴性菌DNA提取方法f61进行。

13第一类整合子结构的检测扩增第一类整合子5保守端整合酶基因intll的上、下游的引物分别为INT1U（5-GITCGGTCAAGGTrCTG-3）和INTID（57一GCCAACTITCAGCACA7r（3）。

扩增3保守端的上、下游的引物分别为qacEAI-F5ATCGCAA7rACTTGGCGAAGl-37和sullB5GCAAGGCGGAAACCCGCGCC3（弓J物均由TAKARA生物工程公司合成）。

在50山反应总体积中加入10PCR缓冲液5斗l，dNTP4p,l，上、下游引物各51xl，无菌去离子水25751xl，DNA模板5pl，025斗lTaqDNA聚合酶（5UIM，TAKARA生物工程公司）。

应用LifeExpressThermalCycler系统，intll扩增循环条件：

裂解温度945rain，每个循环为94cc05rain，5005min，7215rain，30个循环，最后延伸72cc7min。

对3保守端的扩增条件为：

9405rain，56lmin，72lmin，30个循环，最后延伸72qC7min。

14反向PCR扩增intll的旁翼序列141茨昂威沙门菌S191基因组DNA的限制性酶切在灭菌、洁净的PCR反应管中加人如下组分：

基因组DNAIOv,I，10缓冲液2斗l去离子水7山，胁以或EcoRVl斗l，轻混后37放置2h，最后用酚氯仿将酶切的基因组DNA进行抽提纯化。

142DNA自身环化反应同样，在灭菌、洁净的PCR反应管中加入酶切DNA201M，T4DNA连接酶1斗l，10T4DNA缓冲液25trl和无菌水151xl，放入PCR仪中，10反应24rain，之后在94反应15min终止反应。

143反向PCR反应根据扩增第一类整合酶基因intll的引物INT1U和INT1D设计，反向引物为I-INTu（5-CAGAACCrlTGACCGAAC一37）和I-INTD（57一CATGTGCCTGAAAGTTGGC一3）由上海生工生物工程公司合成。

在50恤l反向PCR反应体系中加人10ExTaq缓冲液5txl，dNTP4恤l，I1NTU5斗1，I-INTD5txl，环化DNA1斗l，Ex细酶（TAKARA生物工程公司）025t上1和灭菌水2925txl。

循环条件：

94预变性5min，94变性lmin，55cc退火1min，?

2延伸3min，共30循环，最后72延伸10rain。

15扩增产物的检测取PCR产物5“l，以l或07浓度（反向PCR产物）的琼脂糖凝胶上100V电泳20rain，在EB溶液染色lOmin，水洗10min，在BIORADGelDoc2000凝胶成像系统检验结果，其中反向PCR产物（即第一类整合子的旁翼序列DNA）使用QIAquickPCRPurifica-tionKit和QIAquickGelExtractionKit（QIAGEN）进行纯化，纯化后的产物用20mTE稀释并在一20贮存，以备以后进一步克隆和分析使用。

16扩增产物的纯化、测序及序列分析反向扩增得到的产物使用QIAquickPCRPufificationKit和QIAquiekGelExtractionKit（QIAGEN）进行纯化，方法按照指导说明的进行；使用dRhodamineTerminatorCycleSequencingFSReadyReactionKil在ABIPRISM310测序仪（AppliedBiosystems公司）上对DNA序列；使用DNAtools软件以m哪ncbinlmnihgov网站对序列进行分析，应用Standardnue