反向PCR法扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列_精品文档.pdf

1、中国抗生素杂志2 0 0 8 年2 月第3 3 卷第2 期文章编号：1 0 0 1 8 6 8 9(2 0 0 8)0 2-0 1 1 1-0 3反向P C R 法扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列张宏梅1石磊2 李琳2(1 广东工业大学轻化工学院。广州5 1 0 0 0 6；2 华南理工大学食品与生物工程学院，广州5 1 0 6 4 1)摘要：目的第一类整合子在介导细菌耐药中起重要作用。本研究采用反向P C R 方法对第一类整合子旁翼序列进行分析。方法以具有典型第一类整合子结构的茨昂威沙门菌(S 如h o n g w e)S 1 9 1 为研究对象，分别用E c o R V 和H i n d

2、 I I I 两种限制性内切酶对基因组D N A 进行酶切。并对酶切产物进行自身环化，通过设计第一类整合酶基因的反向引物来扩增第一类整合子的旁翼序列。结果分别扩增得到1 5 0 0 和6 0 0 0 b p 左右大小的第一类整合子旁翼序列。结论进一步明确了第一类整合子的结构，并为第一类整合子调控因子的分析和克隆奠定研究基础。关键词：反向P C R；整合子；整合酶中图分类号：R 3 7 8 2+2文献标识码：A。A m p l i f i c a t i o no fn e i g h b o rD N As e q u e n c eo fc l a s s1i n t e g r o nu

3、s i n gr e v e r s eP C RZ h a n gH o n g-m e i l，S h iL e i za n dL iL i n 2(1D e p a r t m e n to fF o o da n dB i o l o g i c a lE n g i n e e f i n g，G u a n g d o n gU n i v e r s i t yo ft e c h n o l o g y，G u a n 屏h o u510 0 0 6；2C o f i e g eo fF o o da n dB i o l o g i c a lE I l g i n e e

4、 f i n g，S o u t hC h i n aU n i v e r s i t yo fT e h n o l o g y G 呦g z l O U5 1 0 6 4 1)A B S T R A C TO b j e c t i v eT h en e i g h b o rD N Ao fc l a s s1i n t e g r o nw a si n v e s t i g a t e du s i n gr e v e r s eP C R M e t h o dI n t e g r o n p o s i t i v eSt s h i o n g w eS191w a

5、st h es a m p l e C h r o m o s o m a lD N Ao fS t s h i o n g w eS19 1w a sd i g e s t e d b yH i n d1 1 1o rE c o RVa n dw a se y c l i z a t e di t s e l f I n v e r s ep r i m e r sw e r ed e s i g n e df o ra m p l i f i c a t i o no fc l a s s1i n t e g r a s e R e s u l tA m p l i c o n so f1

6、，5 0 0 b pa n d6，0 0 0 b pw e r eo b t a i n e d C o n c l u s i o nT h es t r u c t u r eo fc l a s s1i n t e g r o nW a sd e m o n s t r a t e dw e l la n dt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sw e r ea l s o l a i daf o u n d a t i o nf o rc o n t r o l l i n gt h ee x p r e s s i o no fa n t

7、i b i o t i cr e s i s t a n c ea m o n gb a c t e r i a K E YW O R D SR e v e r s eP C R；I n t e g r o n；I n t e g r a s e整合子对细菌耐药性的介导作用，已经引起研究人员的广泛注意，尤其第一类整合子在耐药菌中分布最广泛，占有重要地位。在以往研究中，对沙门菌第一类整合酶基因阳性菌株的指纹图谱及其检测方法都已有探讨f I 引，但是对第一类整合酶基因及耐药基因盒的调控序列研究报道却极少。现已知，一个基因的表达在很大程度上是由它的旁侧序列调控的，克隆基因的旁侧序列已经成为分子生物学

8、研究中的常规工作之一。在测定已知基因片段的旁测基因序列方法上，常用的有染色体D N A 步移、锚定引物P C R、加人衔接头等方法”。l，其中应用染色体D N A 步移的方法以其准确性高而常用。反向P C R 技术可以对一个已知序列D N A 的两侧未知序列进行扩增和研究，也称染色体步移。该方法常用于检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，建立基因组步移文库及研究基因的上游调控元件，在分子生物学研究中有广泛应用。本文以第一类整合子阳性菌株茨昂威沙门菌(S t s h i o n g w e)S 1 9 1 为研究对象，采用反向P C R 方法扩增第一类整合子的旁翼序列。1材料和方法1 1菌株茨

9、昂威沙门菌S 1 9 1 由广州市东山卫生防疫站提供。霍乱弧菌(驴c h o l e r a e)O l 群S K 1 0 第一类整合子阳性对照菌株，大肠埃希菌(Ec o l i)C 6 0 0 第一类整合收稿日期：2 0 0 7 1 0 1 7基金项目：国家自然科学基金(项目批准号：2 0 7 0 7 0 0 3)。作者简介：张宏梅，女，生于1 9 7 5 年，讲师。通讯作者。E m a i l：l e i s h i s c u t e d u c n 万方数据反向P C R 法扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列张宏梅等子阴性对照菌株，日本大阪府立大学国际防疫学研究室惠赠。1 2基因组D

10、N A 的提取对茨昂威沙门菌S 1 9 1 基因组D N A 为模板D N A，参照革兰阴性菌D N A 提取方法f 6 1 进行。1 3第一类整合子结构的检测扩增第一类整合子5 保守端整合酶基因i n t l l 的上、下游的引物分别为I N T 1 U(5 -G I T C G G T C A A G G T r C T G-3)和I N T I D(57 一G C C A A C T I T C A G C A C A 7 r(3)。扩增3 保守端的上、下游的引物分别为q a c E AI-F5 A T C G C A A 7 r A C T T G G C G A A G l -3 7

11、 和s u l l B5 G C A A G G C G G A A A C C C G C G C C 3(弓J 物均由T A K A R A生物工程公司合成)。在5 0 山反应总体积中加入1 0 P C R 缓冲液5 斗l，d N T P4 p,l，上、下游引物各5 1 x l，无菌去离子水2 5 7 5 1 x l，D N A 模板5 p l，0 2 5 斗lT a q D N A 聚合酶(5 U I M，T A K A R A 生物工程公司)。应用L i f eE x p r e s sT h e r m a lC y c l e r 系统，i n t l l 扩增循环条件：裂解温度9

12、 4 5 r a i n，每个循环为9 4 c c0 5 r a i n，5 0 0 5 m i n，7 2 1 5 r a i n，3 0 个循环，最后延伸7 2 c c7 m i n。对3 保守端的扩增条件为：9 4 0 5 r a i n，5 6 l m i n，7 2 l m i n，3 0 个循环，最后延伸7 2 q C7 m i n。1 4反向P C R 扩增i n t l l 的旁翼序列1 4 1茨昂威沙门菌S 1 9 1 基因组D N A 的限制性酶切在灭菌、洁净的P C R 反应管中加人如下组分：基因组D N AI O v,I，1 0 缓冲液2 斗l 去离子水7 山，胁以或E

13、 c o R Vl 斗l，轻混后3 7 放置2 h，最后用酚氯仿将酶切的基因组D N A 进行抽提纯化。1 4 2D N A 自身环化反应同样，在灭菌、洁净的P C R 反应管中加入酶切D N A2 0 1 M，T 4D N A 连接酶1 斗l，1 0 T 4 D N A 缓冲液2 5 t r l 和无菌水1 5 1 x l，放入P C R 仪中，1 0 反应2 4 r a i n，之后在9 4 反应1 5 m i n终止反应。1 4 3反向P C R 反应根据扩增第一类整合酶基因i n t l l 的引物I N T 1 U 和I N T 1 D 设计，反向引物为I-I N T u(5 -C

14、A G A A C C r l T G A C C G A A C 一37)和I-I N T D(57一C A T G T G C C T G A A A G T T G G C 一3)由上海生工生物工程公司合成。在5 0 恤l 反向P C R 反应体系中加人1 0 E xT a q 缓冲液5 t x l，d N T P4 恤l，I 1 N T U5 斗1，I-I N T D5 t x l，环化D N A1 斗l，E x 细酶(T A K A R A 生物工程公司)0 2 5 t 上1 和灭菌水2 9 2 5 t x l。循环条件：9 4 预变性5 m i n，9 4 变性l m i n，5

15、5 c c 退火1 m i n，?2 延伸3 m i n，共3 0 循环，最后7 2 延伸1 0 r a i n。1 5扩增产物的检测取P C R 产物5“l，以l 或0 7 浓度(反向P C R产物)的琼脂糖凝胶上1 0 0 V 电泳2 0 r a i n，在E B 溶液染色l O m i n，水洗1 0 m i n，在B I O R A DG e lD o c2 0 0 0 凝胶成像系统检验结果，其中反向P C R 产物(即第一类整合子的旁翼序列D N A)使用Q I A q u i c kP C RP u r i f i c a-t i o nK i t 和Q I A q u i c k

16、G e lE x t r a c t i o nK i t(Q I A G E N)进行纯化，纯化后的产物用2 0 mT E 稀释并在一2 0 贮存，以备以后进一步克隆和分析使用。1 6扩增产物的纯化、测序及序列分析反向扩增得到的产物使用Q I A q u i c kP C RP u f i f i c a t i o nK i t 和Q I A q u i e kG e lE x t r a c t i o nK i t(Q I A G E N)进行纯化，方法按照指导说明的进行；使用d R h o d a m i n eT e r m i n a t o rC y c l eS e q u e n c i n gF S R e a d yR e a c t i o nK i l 在A B IP R I S M3 1 0 测序仪(A p p l i e dB i o s y s t e m s 公司)上对D N A 序列；使用D N A t o o l s 软件以m 哪n c b i n l m n i h g o v 网站对序列进行分析，应用S t a n d a r dn u e