临床试验SOP 第四节仪器操作类SOP 的撰写指南.docx
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临床试验SOP第四节仪器操作类SOP的撰写指南
第四节仪器操作类SOP的撰写指南
在各期临床试验、生物等效性研究及临床药代动力学研究过程中，必然要涉及许多与诊断、治疗有关的仪器设备的操作。
因此，建立各种仪器设备操作的SOP、并严格按照SOP正确使用这些仪器设备是保证临床试验成功的保证。
一主要内容
仪器操作类SOPs包括了与临床试验有关的各种诊断检查、检验分析仪器设备和治疗急救仪器操作，内容广泛，现举例如下：
1.心电图机标准操作规程；
2.动态心电监护仪标准操作规程；
3.2003型多参数监护仪标准操作规程；
4.LH-1ECG/心律失常模拟器标准操作规程（用于检验心电图机、监护仪以及无线遥测设备的准确性）；
5.呼吸机标准操作规程；
6.脑电图仪测标准操作规程；
7.肺活量测定标准操作规程；
8.（电子）血压计标准操作规程；
9.动脉血氧饱和度（SpO2）监护标准操作规程；
10.床边X光机标准操作规程；
11.B超诊断仪标准操作规程；
12.高效液相色谱仪标准操作规程；
13.高效液相色谱法测定生物样品药物浓度标准操作规程；
14.血药浓度监测仪标准操作规程；
15.WD-21D型生化分析仪标准操作规程，等等。
以上只举出临床试验过程中的部分仪器操作类SOPs。
实际上，对药物临床试验机构来讲，涉及到的仪器设备远远不止这些。
而且，同种仪器设备也可能由于不同厂家生产、或型号规格不同使得制定SOP的数量倍增，因此很难说这类SOP究竟多少份就足够。
二编写要点
由于仪器操作类SOPs包括内容广泛，种类繁多，而且各具特色，所以在撰写此类SOP时特别需要根据每个仪器操作程序、环节的不同特点来进行编写。
流程图可简明、清晰地传达信息，故程序性较强的环节可考虑用流程图来描述。
仪器操作类SOPs要注意其内容在排序上与实际操作一致，以保证其可行性。
在仪器操作类SOPs中除了正确的操作程序外，还应建立质量保证体系。
该体系包括适当的维护、检测和校准程序保证各仪器处于正常运行状态。
在一些临床药代动力学的研究，如生物样本浓度测定中，还使用各种方法学确证手段和质控样品，来保证实验方法和结果的准确、可靠。
（一）范例1：
高效液相色谱仪测定西肽普兰的标准操作规程
高效液相色谱仪测定西肽普兰的标准操作规程
SOP编号：
页数：
制订人：
审核人：
批准人：
（签名、日期）（签名、日期）（签名、日期）
颁发日期：
生效日期：
修订登记：
编号
页码
修订内容
修订原因、依据
修订人
签名/日期
批准人
签名/日期
审查登记：
审查日期
签名
审查日期
签名
1
4
2
5
3
6
Ⅰ.目的：
此SOP的目的是定量和定性测定人血浆中西肽普兰浓度
Ⅱ.范围：
适用于西肽普兰的临床药代动力学研究
Ⅲ.规程：
1.标准品：
氢溴酸西酞普兰对照品（批号：
030902，纯度：
％，汕头XX制药总厂），盐酸普萘洛尔（批号：
030604，纯度：
％，汕头XX制药总厂）。
2.试剂
2.1乙腈：
色谱纯试剂（Merk，德国）；
2.2其它试剂：
为分析纯试剂。
三乙胺（分析纯，XX永生试剂厂），磷酸二氢钾（分析纯，广州化学试剂厂）；氢氧化钠（分析纯，广州市东红化工厂）；盐酸（分析纯，广州化学试剂厂）；正己烷（分析纯，广州化学试剂厂）；异戊醇（分析纯，广州化学试剂厂）；
2.3水：
去离子水，再用Millipore超纯水系统进行纯化，滤膜孔径为0.2μm。
3.仪器设备
3.1Waters高效液相色谱系统（600E低压梯度泵，717自动进样器，474荧光检测器，Mellenium32色谱工作站）；
3.2XW-80A漩涡混合器（XX医科大学仪器厂）；Sigma冷冻离心机；高速离心机（美国雅培公司血药浓度监测仪附件）。
1.0溶液制备
4.1标准溶液配制
4.1.1精密称取西酞普兰标准品10.0mg，置于100mL容量瓶，以甲醇溶解并定容，得100µg/mL的西酞普兰储备液；
4.1.2取西酞普兰储备液25、50、75、100、250、500、1000µL，分别置于100mL容量瓶，以甲醇稀释并定容，配制浓度分别为25﹑50﹑75、100、250、500、1000ng/mL的西酞普兰标准溶液。
4.2内标液的配制
4.2.1精密称取普萘洛尔0.4mg置于100mL容量瓶，以甲醇溶解并定容，得浓度为4µg/mL的内标液。
4.3流动相配制
4.3.1精密称取4.08gKH2PO4，溶于950mL蒸馏水，混匀后备用；
4.3.2用移液器量取0.1mL三乙胺置于100mL容量瓶，加95mL蒸馏水手动混匀，再加蒸馏水至刻度，混匀后备用；
4.3.3用％三乙胺调KH2PO4溶液pH到，并用蒸馏水稀释到1000mL，混匀；
4.3.4各取的KH2PO4溶液6份和乙腈4份混合，尼龙膜过滤脱气后备用；
4.3.5注：
实际量取的KH2PO4溶液和乙腈体积必须在实验记录本上予以记录。
4.40.2MNaOH溶液的配制
4.4.1精密称取0.8gNaOH，置于100mL容量瓶，用蒸馏水溶解并定容，混匀后备用。
4.50.01MHCl溶液的配制
4.5.1精密量取84µL37%的浓HCl，加入95mL蒸馏水（100mL容量瓶），再用蒸馏水定容，混匀后备用。
4.6正己烷－异戊醇（98∶2，v/v）溶液的配制
4.6.1分别量取980mL正己烷和20mL异戊醇，置于1000mL玻瓶，混匀后备用。
5.1加样血浆样品的配制
5.1将10µL的25﹑50﹑75、100、250、500、1000、5000、10000ng/mL西酞普兰标准溶液加入1mL空白血浆，漩涡混合30s，配置成、、0.75、1、、5、10、50、100ng/mL的西酞普兰标准血浆溶液备用。
6.1样本提取过程
6.1取血浆样品1mL置10mL玻璃试管中，准确加入内标溶液（普萘洛尔4µg/mL）25µL，漩涡混合30s；
6.2加入0.2MNaOH溶液500µL，漩涡混合30s；
6.3加入正己烷－异戊醇（98∶2，v/v）溶液4mL，漩涡混合2min，离心（4500rpm）10min；
6.4分离有机层转移至10mL尖底玻璃试管中，加入0.01MHCl溶液200µL，漩涡混合2min，离心（4500rpm）5min；
6.5弃去上层有机相，吸取下层水相100µL进样，记录色谱图。
7.1色谱条件
7.1色谱柱：
×250mm），色谱科公司，或其它C18柱
7.2保护柱：
在线过滤器
7.3流动相：
乙腈－30mMKH2PO4缓冲液（用％三乙胺调pH到）=40∶60（v/v）
7.4流速：
1.3mL/min
7.5柱温：
室温
7.6荧光检测器
激发波长：
236nm，发射波长：
306nm
7.7自动进样器参数：
进样体积为100μL
7.8数据收集时间：
15min
8.1仪器设置和平衡
8.2仪器设置和平衡
8.1.1开机：
打开高效液相色谱仪各系统电源，确认各系统运行正常；
8.1.2冲洗色谱柱：
按以下顺序冲洗：
50/50的水/乙腈冲洗15min，10/90的水/乙腈冲洗15min，50/50的水/乙腈冲洗15min，90/10的水/乙腈冲洗15min；
8.1.3用流动相平衡色谱柱。
8.3样品分析
8.2.1上样：
将待分析的样品转移到自动进样器样品管，标准血浆样品和质控样品必须均匀分布到未知待测样品中；
8.2.2在开始和结束时各进一次标准品，样品量多时，还须在中间进一次标准品；
8.2.3色谱工作站软件的设置和使用SOP另述。
8.4关机
8.3.1.冲洗色谱柱：
分析结束后按以下顺序冲洗：
90/10的水/乙腈冲洗30min，50/50的水/乙腈冲洗15min，10/90的水/乙腈冲洗30min，50/50的水/乙腈冲洗15min，色谱柱在50/50的水/乙腈条件保存；
8.3.2.关机：
关闭电源。
9.1数据分析
9.1样品和内标峰的确定：
根据标准品的保留时间确定样品和内标峰。
保留时间的变异为1min；
9.2浓度计算
9.2.1用峰面积定量，峰面积由色谱软件自动计算，并由人工进行检查和调整峰面积计算的起始点；
9.2.2样品浓度由分析者根据标准曲线进行计算。
9.3保存每一个色谱图，并按要求打印部分或全部色谱图；
9.4典型色谱图在该SOP的结尾。
10.1方法学确证
10.1特异性（Specificity）
10.1.1特异性是指样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定西酞普兰的能力
10.1.2至少要考察6个不同个体空白血浆样品色谱图、空白血浆样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的血浆样品色谱图反映分析方法的特异性。
西酞普兰与内标分离良好，西酞普兰和内标的保留时间分别为和见图1。
图1西酞普兰的HPLC色谱图
A－空白血浆色谱图；B－空白血浆＋标准品色谱图；B－血浆样品色谱图
1－内标；2－西酞普兰
10.2标准曲线和定量范围（CalibrationCurve）
10.2.1标准曲线反映了所测定物质浓度与仪器响应值之间的关系，一般用回归分析方法（如用加权最小二乘法）所得的回归方程来评价；
10.2.2应提供标准曲线的线性方程和相关系数，其线性相关程度应。
标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度；
10.2.3必须至少用6个浓度建立标准曲线；
10.2.4定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度；
10.2.5建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点，仅用于评价干扰；
10.2.6标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差（偏差=[（实测值－标示值）/标示值]×100%）在可接受的范围之内时，可判定标准曲线合格。
可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在±20%以内，其余浓度点的偏差在±15%以内。
只有合格的标准曲线才能对临床待测样品进行定量计算；
10.2.7当线性范围较宽的时候，推荐采用加权的方法对标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确。
10.2.8西酞普兰的标准曲线（0.5~100ng/mL）为：
，，以信噪比S/N＝3∶1计，最低检测浓度为0.5ng/mL。
10.3定量下限（LowerLimitofquantitation，LLOQ）
定量下限是标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。
其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内，相对标准差（RSD）应小于20%。
应由至少5个标准样品测试结果证明。
西酞普兰的定量下限为0.5ng/mL。
10.4精密度与准确度（PrcisionandAccuracy）
10.4.1精密度是指在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。
通常用质控样品的批内和批间RSD来考察方法的精确度。
一般RSD应小于15％，在LLOQ附近RSD应小于20％。
选择高（70ng/mL）、中（30ng/mL）、低（2.5ng/mL）3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度考察，批间精密度为连续考察5天的结果。
西酞普兰的批内精密度和批间精密度见表1；
10.4.2准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度（即质控样品的实测浓度与真实浓
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