实验室标准操作规程SOP.docx

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实验室标准操作规程SOP

实验室标准操作程序

（SOP）

版号：

第一版

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2007年08月08日实施日期:

2007年08月08日

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备注

00.目录

章节

标题

页数

01

细菌总数的检验

4

02

大肠菌群、大肠杆菌的检验

5

03

金黄色葡萄球菌的检验

5

04

沙门氏菌的检验

6

05

副溶血性弧菌的检验

7

06

霍乱弧菌的检验

8

07

单核细胞增生李斯特氏菌的检验

9

08

志贺氏菌的检验

10

09

霉菌的检验

11

10

表面样品的检验

12

11

水的检验

13

01.出口食品细菌总数的检验方法

1.仪器和设备

1．1恒温培养箱：

36±1℃

1．2恒温水浴箱：

45±1℃

1．3高压灭菌锅

1．4均质器

1.5冰箱：

0-4℃和-15～-20℃

1．6试管:

18×150mm

1．7锥形瓶:

500ml250ml

1．8平皿：

直径为90mm

1．9灭菌吸管

1．10灭菌均质杯

1．11酒精棉

1．12天平:

感量0.1g

2．培养基的制备

2.1生理盐水:

称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中,分装锥形瓶和试管内,每管吸9ml，121℃高压灭菌。

2.2平板计数琼脂

称平板计数琼脂23.5g加入1000.0ml蒸馏水中，煮沸溶解，分装锥形瓶内，121℃高压灭菌。

3.操作程序

3.1样品稀释

以无菌操作取25g样品放入装有225ml生理盐水的灭菌均质杯内，

均质1分30秒，制成1：

10的样品匀液用灭菌吸管吸取1ml样液

放入9ml生理盐水中，摇匀。

从试管中吸取1ml样液分别注入两个平皿内，

制成10倍的样品稀释液，依次类推（10-2、10-3）平板计数琼脂（恒温45±1℃）

分别倒12-15ml平板计数琼脂入各平皿待琼脂凝固后将平皿翻转

立即将平皿内的样液和琼脂充分混合将平皿旋转，注意倾注时间不宜太长

立即放进36±1℃的恒温培养箱内培养48±2h

3.2培养

4.计算如下表（备注：

25-250个菌落为合适范围，菌落成链状明显的计为一个菌落，不明显的不计数，平皿边缘和琼脂表面成水膜样菌落或生长过量的，即报告为蔓延菌落。

）

样品号

菌落数

平皿菌落数

1：

101：

1001：

1000

1

238160

212180

2.3×103个/g

2

236260

227280

2.5×103个/g

3

1800

1440

1.6×102个/g

4

多不可计24523

多不可计27820

2.6×104个/g

5

000

000

＜10个/g

6

多不可计25521

多不可计22540

2.7×104个/g

7

多不可计21018

多不可计24028

2.3×104个/g

8

多不可计26030

多不可计23028

2.7×104个/g

9

多不可计多不可计523

多不可计多不可计487

5.1×105个/g

10

多不可计24535

多不可计230蔓延菌落

2.9×104个/g

02.出口食品大肠菌群和大肠杆菌的检验方法

1．仪器和设备

1．1恒温培养箱：

36±1℃

1．2恒温水浴箱：

44.5±1℃

1．3高压灭菌锅

1．4均质器

1．5试管:

18×150mm、18×180mm

1．6锥形瓶:

500ml250ml

1．7平皿：

直径为90mm

1．8灭菌均质杯

1．9灭菌吸管

1．10酒精棉

1．11天平：

感量0.1g

1.12冰箱：

0-4℃和-15～-20℃

1.13显微镜

2．培养基的制备

2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤

称35.6g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm试管中，每管10ml，于121℃高压灭菌15min。

2.2煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）

称40g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm试管中，每管10ml，121℃高压灭菌15min。

2.3EC肉汤

称37g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于有倒立的小发酵管的18×180mm试管中，每管吸8ml，121℃高压灭菌15min。

2.4伊红美蓝琼脂（EMB）

称37.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装于三角烧瓶，121℃高压灭菌15min。

摇匀冷却至45℃倾注平皿。

2.5营养琼脂

称33g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，121℃高压灭菌15min。

制成斜面备用。

2.6生理盐水

称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，分装锥形瓶和18×150mm试管内，121℃高压灭菌15min。

2.7成品生化管

2.7.1色氨酸肉汤2.7.2MR-VP2.7.3Koser氏枸橼酸盐琼脂2.7.4革兰氏染色试剂盒2.7.5Kovacs氏靛基质试剂2.7.6甲基红指示剂2.7.7V-P试剂甲液和乙液

3.操作步骤

3.1样品的稀释和培养

用灭菌吸管吸取1ml均质好的样液

放入9ml生理盐水中，摇匀

分别注入中间3支LST中，

作为千倍的连续稀释度的稀释液

未产气报告为阴性,产气者进一步实验

3.2大肠菌群的测定

查MPN表报告大肠菌群的MPN值

3.3大肠杆菌的测定

如产气将培养物接种于EMB平板

如有菌落挑两个典型的接种营养斜面

36±1℃培养18~24h

3.4将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化实验。

3.4.1

上层出现红色为阳性反应

40％KOH溶液0.2ml和少许肌酸结晶

3.4.2

如变红为阳性，变黄为阴性

3.4.3

36±1℃培养96h记录有无生长

Koser氏枸橼酸盐琼脂

3.4.4

大肠杆菌为革兰氏阴性

靛基质

MR

VP

枸橼酸盐

鉴定（型别）

＋

－

＋

＋

－

－

－

－

典型大肠杆菌

非典型大肠杆菌

3.4.5大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：

3.5结果报告：

大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为＋＋－－或－＋－－，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克样品中大肠杆菌MPN值。

1g样品中最近似值（MPN）表

使用三管法,接种量分别为0.1g,0.01g,0.001g

阳性管数

MPN

阳性管数

MPN

0.10.010.001

0.10.010.001

0

0

0

＜3

2

0

0

9.1

0

0

1

3

2

0

1

14

0

0

2

6

2

0

2

20

0

0

3

9

2

0

3

26

0

1

0

3

2

1

0

15

0

1

1

6.1

2

1

1

20

0

1

2

9.2

2

1

2

27

0

1

3

12

2

1

3

34

0

2

0

6.2

2

2

0

21

0

2

1

9.3

2

2

1

28

0

2

2

12

2

2

2

35

0

2

3

16

2

2

3

42

0

3

0

9.4

2

3

0

29

0

3

1

13

2

3

1

36

0

3

2

16

2

3

2

44

0

3

3

19

2

3

3

53

1

0

0

3.6

3

0

0

23

1

0

1

7.2

3

0

1

39

1

0

2

11

3

0

2

64

1

0

3

15

3

0

3

95

1

1

0

7.3

3

1

0

43

1

1

1

11

3

1

1

75

1

1

2

15

3

1

2

120

1

1

3

19

3

1

3

160

1

2

0

11

3

2

0

93

1

2

1

15

3

2

1

150

1

2

2

20

3

2

2

210

1

2

3

24

3

2

3

290

1

3

0

16

3

3

0

240

1

3

1

20

3

3

1

460

1

3

2

24

3

3

2

1100

1

3

3

29

3

3

3

＞1100

备注：

1.上表采用3个稀释度（0.1g、0.01g和0.001g）每个稀释度3管。

2.如检样量改用1g、0.1g和0.01g时，表内数字相应降低10倍；如改位0.01g、0.001g和0.0001g时，表内数字相应增加10倍，其余类推。

03.出口食品金黄色葡萄球菌的检验方法仪器和设备

1．1恒温培养箱：

36±1℃

1．2恒温水浴箱：

45±1℃

1．3高压灭菌锅

1．4均质器

1．5试管:

18×150mm18×180mm

1．6锥形瓶:

500ml250ml

1．7平皿：

直径为90mm

1．8灭菌吸管

1．9灭菌均质杯

1．10酒精棉

1．11天平:

感量0.1g

1．12冰箱：

0-4℃和-15～-20℃

2．培养基的制备

2.1生理盐水

称氯化钠8.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，分装锥形瓶和18×150mm试管内，每管吸9ml,121℃高压灭菌15min。

2.2胰蛋白胨大豆肉汤

称大豆肉汤30g和氯化钠95g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装18×180mm试管内，每管吸10ml,121℃高压灭菌15min。

2.3Baird-parker培养基

称6.3g溶于95ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装锥形瓶内，121℃高压灭菌15min。

冷却至50℃，加入1瓶亚碲酸钾卵黄增菌液（冻干粉加5ml无菌生理盐水溶解）混匀。

倾注平板备用，待平板凝固后放入冰箱0-4℃。

2.4普通肉汤培养基

称18g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，分装18×180mm试管，每管吸10ml，121℃高压灭菌15min。

2.5冻干血浆（凝固酶试验）

每支安瓶中加入0.5ml灭菌生理盐水至完全溶解，然后加入0.3ml待检液，于37℃6h培养，观察判定结果。

3.操作步骤

3.1样品的稀释和培养

用灭菌吸管吸取1ml均质好的样液

分别注入中间3支大豆肉汤中，

作为千倍的连续稀释度的稀释液

再从每一平板上挑取1个可疑菌落

观察6h是否有凝块，完全凝固为阳性

备注：

金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker琼脂平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润，直径2～3mm。

灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围饶以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带。

当用接种针触及菌落时具有黄油样粘