一种来源于中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因撰写1122.docx

一种来源于中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因撰写1122.docx

《一种来源于中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因撰写1122.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种来源于中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因撰写1122.docx（14页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

一种来源于中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因撰写1122

说明书摘要

一种来源于中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因及其克隆方法，该方法包括步骤：

（1）根据Genebank中不同物种的delta6去饱和酶基因进行对比，获得的保守序列，设计保守区序列引物FAD6-F1（+）/FAD6-R1（-），以中华绒螯蟹肝胰99999腺总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因片段核心片段，将核心片段克隆到载体上并测序；

（2）根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5’-和3’-RACE引物，FAD6-5’（-）和FAD6-3’（+），以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的5’-cDNA和3’-cDNA为模板，进行RACE反应，获得5’和3’末端片段，将得到的该片段分别连接至载体后克隆并测序；（3）将5’和3’末端片段分别与获得的delta6去饱和酶基因核心片段进行拼接得到delta6去饱和酶基因全长序列。

摘要附图

权利要求书

1.一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:

1所示。

2.一种权利要求1所述的中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:

2所示。

3.权利要求1所述的中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因的克隆方法，该方法包括以下步骤：

（1）根据Genebank中不同物种的delta6去饱和酶基因进行对比，获得的保守序列，设计保守区序列引物FAD6-F1（+）和FAD6-R1（-），以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因片段核心片段，将核心片段克隆到载体上并测序，

FAD6-F1（+）的核苷酸序列如SEQIDNO:

3所示，FAD6-R1（-）的核苷酸序列如SEQIDNO:

4所示；

（2）根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5’-和3’-RACE引物，FAD6-5’（-）和FAD6-3’（+），以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的5’-cDNA和3’-cDNA为模板，进行RACE反应，获得5’和3’末端片段，将得到的该片段分别连接至载体后克隆并测序，

FAD6-5’（-）的核苷酸序列如SEQIDNO:

5所示，FAD6-3’（+）的核苷酸序列如SEQIDNO:

6所示；

（3）将5’和3’末端片段分别与所述核心片段进行拼接得到delta6去饱和酶基因全长序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤

（1）和

（2）中总RNA是从中华绒螯蟹肝胰腺中通过Trizol法提取得到的。

5.根据权利要求3所述的方法，步骤

（1）和

（2）中所述载体是pGEM-T质粒

6.一种载体，其包括权利要求1所述的中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因。

7.一种转染细胞，其包括权利要求5所述的载体。

8.一种转染细胞，其表达权利要求2所述的蛋白。

9.根据权利要求7或8所述的转染细胞，其中所述细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或金斯瑞酵母中一种。

10.根据权利要求9所述的转染细胞，其中所述转染细胞为大肠杆菌。

说明书

一种中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因及其克隆方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因及其克隆方法。

背景技术

多不饱和脂肪酸（PUFA）是生物膜结构的重要组成部分，同时对人类的健康也具有重要作用，膳食中摄入的PUFA对心律失常有抑制作用，并且PUFA对心血管疾病的辅助治疗和预防也发挥了一定作用。

此外，LC-PUFA与人体的健康更加密切相关，如二十二碳六烯酸（DHA）可关系到胎儿的生长，发育，某些LC-PUFA还可以降低炎症、癌症及心脑血管疾病的发病率等。

当前常见的多不饱和脂肪酸EPA和DHA的来源主要是深海鱼油，然而随着市场需求的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少，该途径已经远远不能满足需要。

此外环境污染等原因致使鱼油中的重金属含量越来越高。

因此，寻找更为持续稳定的EPA和DHA来源已经成为当务之急。

探索利用转基因技术，例如使转基因的物种成为“绿色工厂”，稳定、高效地生产EPA和DHA是一个重要途径。

脂肪酸去饱和酶（Fattyaciddesaturase，FAD）是生物体合成PUFA的关键酶，可催化饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸酰基链上的双键的形成，使脂肪酸不饱和程度得以提高。

目前已知的多不饱和脂肪酸合成的过程示于图5中，其中delta6去饱和酶是PUFA合成过程中的限速酶，能够催化饱和脂肪酸的第一步去饱和过程，它催化亚油酸（LA）生成γ-亚油酸（GLA），以及催化α-亚麻酸（ALA）生成十八碳四烯酸（stearidnoicacid），它们是EPA及其后DHA生成的关键酶。

目前研究已经从秀丽隐杆线虫、小鼠、斑马鱼、虹鳟、军曹鱼、大西洋鲑鱼、鲈鱼、鲍鱼、金头鲷鱼等中克隆到delta6去饱和酶基因，但是目前有效利用于转基因物种的商业化应用的delta6去饱和酶数量不多，且选择范围小，因此继续克隆并筛选具有较高底物专一性和催化活性的delta6去饱和酶使当前的研究热点之一。

中华绒螯蟹由于其肉味鲜美，营养丰富，深受广大群众的喜爱，是目前水产养殖中的经济养殖物种。

其肝胰腺中脂肪含量达50%，脂肪对中华绒螯蟹的生长和性腺发育具有重要的作用，其中EPA和DHA等PUFA是中华绒螯蟹等蟹类所必需的脂肪酸，因此探索中华绒螯蟹PUFA合成酶的功能具有较大的现实意义。

本发明通过对中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因的克隆、基因的序列分析，对该去饱和酶基因在中华绒螯蟹中的可能作用机制进行了初步探索，为中华绒螯蟹PUFA的合成以及转基因研究开发，例如利用转基因物种生产PUFA所必须的去饱和酶基因，提供了一个基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因。

本发明的另一目的是提供一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因编码的蛋白。

本发明的另一目的是提供一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因的克隆方法。

为了实现上述目的可通过以下技术方案实现：

（1）根据Genebank中不同物种的delta6去饱和酶基因进行对比，获得的保守序列，设计保守区序列引物FAD6-F1（+）和FAD6-R1（-），以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因片段核心片段，将所述核心片段克隆到载体上并测序，

FAD6-F1（+）的核苷酸序列如SEQIDNO:

3所示，FAD6-R1（-）的核苷酸序列如SEQIDNO:

4所示；

（2）根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5’和3’RACE引物FAD6-5’（-）和FAD6-3’（+），以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的5’-cDNA和3’-cDNA为模板，进行RACE反应，获得5’和3’末端片段，将获得的末端片段分别连接至载体后克隆并测序，

FAD6-5’（-）的核苷酸序列如SEQIDNO:

5所示，FAD6-3’（+）的核苷酸序列如SEQIDNO:

6所示；

（3）将5’和3’末端片段分别与所述核心片段进行拼接得到delta6去饱和酶基因全长序列。

在本发明的一个优选实施例中，步骤

（1）和

（2）中总RNA是从中华绒螯蟹肝胰腺中通过Trizol法提取得到的。

在本发明的一个优选实施例中，步骤

（1）和

（2）中所述载体是pGEM-T质粒。

本发明还提供一种载体，其包括中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因。

本发明还提供一种转染细胞，其包括上述载体。

本发明还提供一种转染细胞，其表达上述蛋白。

在本发明的一优选实施例中，该转染细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、金斯瑞酵母等中的一种，优选为大肠杆菌。

与现有的去饱和酶基因相比，本发明的基因具有以下特点：

本发明得到的中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因cDNA的全长序列包括183bp的5’UTR区域、1326bp的ORF和801bp的3’UTR区域，共编码442个氨基酸，其中3’UTR区域具有典型的加尾信号AATAAA及polyA尾。

本发明首次报道从中华绒螯蟹中分离克隆了delta6去饱和酶基因，并且首次通过构建表达载体来验证该基因的功能，并证实了该基因能在大肠杆菌表达系统中稳定表达，且后续蛋白水平上的研究表明，该基因编码的蛋白具有能够将LA和ALA分别转化为γ-亚麻酸和十八碳四烯酸的活性，从而为EPA和DHA等PUFA的合成奠定了底物基础，为进一步研究中华绒螯蟹PUFA的合成提供了一定的依据。

delta6去饱和酶基因编码的氨基酸序列包括：

三个组氨酸簇保守区、一个细胞色素b5结构域以及血红素结合域HPGG，delta6去饱和酶基因编码的氨基酸还含有四次跨膜结构域。

经过序列比对，发现得到的中华绒螯蟹delta6去饱和酶与NCBI上已报道的中华绒螯蟹、罗非鱼、尖吻鲈、大西洋鲑、虹鳟、菁夜蛾及小鼠等物种的delta6去饱和酶氨基酸相似性在40%-76%内。

使用MAGE对上述物种delta6去饱和酶基因相关氨基酸序列构建系统进化树，结果如图3所示。

中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因与菁夜蛾聚为一支，其余物种聚为一大支。

附图说明：

图1显示了中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因的核苷酸序列。

图2显示了中华绒螯蟹的delta6去饱和酶的氨基酸序列。

图3显示了中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因与其它物种delta6去饱和酶氨基酸序列比对。

图4显示了中华绒螯蟹delta6去饱和酶与其它物种FAD6氨基酸序列系统进化树。

图5显示了目前已知的多不饱和脂肪酸合成的过程。

图6-a显示了未加底物的BL21/pCold-fad6菌株脂肪酸图谱。

图6-b显示了空载体BL21/pCold菌株脂肪酸图谱。

图6-c显示了加亚油酸的BL21/pCold-fad6菌株脂肪酸图谱，其中1表示亚油酸，2表示γ-亚麻酸）。

图6-d显示了加α-亚麻酸的BL21/pCold-fad6菌株脂肪酸图谱，其中1表示α-亚麻酸，2表示十八碳四烯酸。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

克隆中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因

（1）根据Genebank中不同物种的delta6去饱和酶基因进行对比，获得的保守序列，设计保守区序列引物FAD6-F1（+）（其核苷酸序列如SEQIDNO:

3）所示和FAD6-R1（-）（其核苷酸序列如SEQIDNO:

4），以Trizol法提取的中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因核心片段。

PCR加样体系为cDNA模板1.0μL，dNTPMixture4.0μL，两种引物（10μM）各0.5μL，10×PCRBuffer（Mg2+Plus）2.5μL，rTaqE（5U/μL）0.25μL，ddH2O16.25μL。

PCR条件为94℃预变性5min，后进行30个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环结束后再72℃延伸10min。

获得的中华绒螯蟹Elovl6基因核心片段克隆到pMD-19T载体并测序。

（2）根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5’和3’RACE引物FAD6-5’（-）（其核苷酸序列如SEQIDNO:

5）和FAD6-3’（+）（其核苷酸序列如SEQIDNO:

6）。

以Trizol法提取的中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成5’-cDNA和3’-cDNA，分别以此cDNA为模板，进行RACE反应，获得5’和3’末端片段。

将获得的末端片段分别连接至载体后克隆并测序。

5’-RACE反应体系为5’-cDNA模板2.5μL，10μM的5’-RACE引物0.5μL，10×UPM（5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC）5.0μL，10mMdNTPMix1.0μL，50×Advantage2PolymeraseMix1.0μL，10×Advantage2PCRbuffer缓冲液5.0μL，加灭菌去离子水至总体积50μL。

反应条件：

94℃30s，72℃2min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃2min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃2min，28个循环，72℃10min。

3’-RACE反应体系为3’-cDNA模板2.5μL，10μM的3’-RACE引物0.5μL，10×UPM（5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’）5.0μL，10mMdNTPMix1.0μL，50×Advantage2PolymeraseMix1.0μL，10×Advantage2PCRbuffer缓冲液5.0μL，加灭菌去离子水至总体积50μL。

反应条件：

94℃30s，72℃2min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃2min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃2min，28个循环，72℃10min。

获得的5’和3’末端侧翼片段分别与pGEM-T连接，克隆并测序。

（3）将获得的5’和3’末端侧翼片段分别与核心片段拼接，获得中华绒螯蟹FAD6cDNA全长序列。

实施例2

重组质粒pCold-TF-fad6的构建及其在大肠杆菌中的表达，表达产物的检测和分析：

提取中华绒螯蟹肝胰腺总RNA，并反转录合成cDNA；根据中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因的全长序列和原核表达载体pColdTFDNA的序列特征设计引物FAD6-F（其核苷酸序列如SEQIDNO:

7）和FAD6-R（其核苷酸序列如SEQIDNO:

8），在引物中引入SacI和BamHI酶切位点，以Trizol法提取的中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的cDNA为模板，扩增出含酶切位点的delta6去饱和酶基因的开放阅读框（ORF），反应体系为：

cDNA模板1.0μL，dNTPMixture（2.5mM）4.0μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，10×PCRBuffer（Mg2+）2.5μL，Taq酶（2.5U/μL）0.5μL，ddH2O16.0μL，反应条件为94℃预变性5min，后进行30个循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，循环结束后再72℃延伸10min。

然后通过琼脂凝胶电泳对所需产物回收纯化，并将其与载体pGEM-T进行连接，转化，筛选出pGEM-fad6阳性克隆菌株，并提取菌液中的重组质粒pGEM-fad6；再将原核表达载体pColdTF和pGEM-fad6质粒分别用限制性内切酶SacI和BamHI进行双酶切，反应体系为：

质粒DNA1μg，10×QuickCutBuffer5μL，QuickCutSacI1μL，加灭菌水至50μL。

将以上体系轻混匀，于水浴锅37℃条件下保温30min，再将其转移至65℃中15min，取出，轻轻混匀后冰上冷却，短暂离心5s，再往其中加入1µLBamHI，混匀后于30℃的水浴锅中反应60min。

1%琼脂糖电泳回收目的产物，最后将回收的表达载体与delta6去饱和酶基因片段连接，构建重组表达质粒pCold-TF-fad6。

连接体系为：

10×T4DNALigaseBuffer2µL，目的基因片段0.12pmol，pColdTF载体0.03pmol，T4DNALigase1µL，加灭菌水至20µL。

16℃条件下连接4h。

对含有重组表达载体pCold-TF-fad6的阳性克隆载体进行复性，扩大培养后进行质粒抽提，然后将重组表达载体转入目的宿主菌BL21（DE3）pLysS中，构建重组菌株BL21/pCold-fad6，将菌株接种于2mL加入34μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基37℃，200r/min下过夜培养活化，后以1:

100比例加入到50mL含34μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min下继续培养，当OD达到0.6-0.8时，加入IPIG使得其浓度为0.3mmol/L，15℃诱导表达10h。

SDS-PAGE分析表明，诱导后的重组表达载体均出现特异性蛋白条带，且与预期结果一致。

对重组蛋白利用镍离子亲和层析柱进行纯化，Western-blotting表明重组蛋白可以和anti-His特异性结合，进一步证明重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。

最后通过气相色谱-质谱联用对重组菌代谢总脂肪酸进行了定性分析，检测表达产物的活性。

诱导后的菌液分为两份，每份100mL装入锥形瓶中，向锥形瓶中分别加入亚油酸和亚麻酸，使得其终浓度均为0.5mmol/L，以不加任何脂肪酸的菌液作对照组，将对照组和实验组均转入15℃、100r/min过夜培养15h。

收集菌液，离心后弃上清，PBS漂洗3次，加入2mL的5%H2SO4-CH3OH溶液90℃下保温2h，冷却后加入3mL0.9%的NaCl溶液和1mL色谱级正己烷，4000r/min离心10min，收集正己烷相，0.22μm滤膜过滤，真空干燥除去正己烷。

干燥后样品加入50μL色谱级正己烷，溶解后取1μL样品利用GC-MS进行检测。

载体为氦气，流速30mL/min，注射器温度220℃，检测口温度220℃，升温程序：

25℃/min速率从60℃上升到150℃，再以同样速率上升至180℃，后以2℃/min升温至220℃保持25min，最后以3℃/min升到225℃保持5min本发明获得的delta6去饱和酶基因表达产物的检测结果见图6-c和6-d。

从图6-b可以看出，所选菌株不含有任何干扰本实验的脂肪酸成分，对比6-a和6-c可知，不加LA的情况下，即使存在delta6去饱和酶，也不会产生γ-亚麻酸，但当在加入LA底物时，检测到γ-亚麻酸的产生，说明本发明获得的delta6去饱和酶对LA具有催化活性，但从脂肪酸的丰度而言，本发明获得的delta6去饱和酶对LA的转化活性较低（详细的用数字说明一下）。

同样对比6-a和6-d可以得出类似的结论，只有在加入ALA的情况下，才会有十八碳四烯酸的存在，且该菌株自身不能合成十八碳四烯酸，说明delta6去饱和酶对ALA也具有一定的活性，且催化活性较LA高（此处最好结合附图用数字说明，而不是泛泛的陈述说明）。

通过上述结论，发明人进一步确定本发明克隆得到的基因为中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因，从而说明了中华绒螯蟹自身具有PUFA合成的关键酶，能够通过在饲料中添加LA和ALA，自身合成EPA等PUFA合成所需要的脂肪酸底物。

（这种描述只是说明了本发明的delta6去饱和酶基因编码的基因具有现有技术已经报道的将LA和ALA分别转化为γ-亚麻酸和十八碳四烯酸的能力，不能说明本发明的delta6去饱和酶基因比已知delta6去饱和酶基因具有明显好的效果，缺乏显著效果的话，后续审查过程中审查员会以缺乏创造性为理由驳回申请）

相比于以往研究，仅对中华绒螯蟹去饱和酶基因进行克隆，并用荧光定量PCR检测该基因在组织中的分布情况，并不能确定克隆得到的基因的功能，但本发明不仅克隆得到中华绒螯蟹的去饱和酶基因，同时通过构建大肠杆菌原核表达载体，将载体导入大肠杆菌中诱导表达，最终证明了该基因能够在大肠杆菌中表达成功，且表达产物具有将LA和ALA分别去饱和生成为γ-亚麻酸和十八碳四烯酸的能力，即具delta6去饱和活性，进一步研究如果能确定中华绒螯蟹延长酶Elovl5和delta5去饱和酶的存在，则可说明中华绒螯蟹饲料中添加LA和ALA即可满足中华绒螯蟹对EPA和DHA等PUFA的需求，从而为进一步研究中华绒螯蟹等甲壳动物脂肪酸代谢提供了一定的基础，也为优化中华绒螯蟹配合饲料的生产提供一定的理论依据。

说明书附图

图1

图2

图3

图4

图5

图6-a图6-b

图6-c图6-d