SN出口食品中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法.docx
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SN出口食品中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
SN0169-92代替ZBX09002一88
Methodforexaminationofcoliform，fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport
1、主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2、设备和材料
2.1 吸管：
1mL，具0.1mL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。
2.2 水浴箱：
44.5±0.5℃。
2.3 培养箱：
36±1℃，44.5±0.5℃。
2.4 冰箱：
0～5℃和-15～-20℃。
2.5 均质器。
2.6 乳钵和研棒。
2.7 平皿：
直径90mm。
2.8 天平：
感量0.1g。
2.9 显微镜。
2.10稀释瓶：
100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11玻璃珠：
直径约5mm。
2.12菌落计数器。
3、培养基及试剂
3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白（胨）（LST）肉汤。
3.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤。
3.3EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂（EMB）。
3.5 营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。
3.7MR-VP培养基。
3.8Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）。
3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11生理盐水。
3.12革兰氏染色液。
3.13Kovacs氏靛基质试剂。
3.14甲基红指示剂。
3.15Voges-proskauer（V-P）试剂。
4、样品制备
4.1 以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。
检验前冷冻样品可于2～5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备
4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠），以30cm幅度、于7s内振摇25次（或以机械振荡器振摇），制成1：
10的样品匀液。
4.2.2 固体和半固体食品
以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1：
10样品匀液（也可用灭菌乳钵研磨的方法代替）。
4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4……。
从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。
5、大肠菌群的测定
5.1 大肠菌群MPN值的测定
5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。
每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤，每管接种1mL。
5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。
5.1.3 观察试管的产气情况：
检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。
如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。
5.2 大肠菌群的证实试验
5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。
5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。
5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4 结果报告：
按BGLB肉汤产气管数，查MPN表[见附录B（补充件）]报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值。
6、粪大肠菌群测定
6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内，培养24±2h。
水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。
应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3 记录EC肉汤管的产气情况。
产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4 结果报告：
按产气管数，查MPN表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的MPN值。
靛基质
MR
VP
枸椽酸盐
鉴定（型别）
＋
＋
－
－
典型大肠杆菌
－
＋
－
－
非典型大肠杆菌
＋
＋
－
＋
典型中间型
－
＋
－
＋
非典型中间型
－
－
＋
＋
典型产气肠杆菌
＋
－
＋
＋
非典型产气肠杆菌
7、大肠杆菌测定
7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，36±1℃培养24±2h。
7.2检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。
用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃培养18～24h。
7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1 色氨酸肉汤：
在36±1℃培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2MR-VP培养基：
在36±1℃培养48±2h。
以无菌操作移取培养物1mL至13mm×100mm试管中，加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL，40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。
如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
7.4.3Koser氏枸椽酸盐肉汤：
于36±1℃培养96h记录有无生长。
7.4.4LST肉汤：
于36±1℃培养48±2h，观察试管中是否产气。
7.4.5 革兰氏染色：
取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。
大肠杆菌为革兰氏阴性。
7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。
7.5 结果报告：
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为＋＋－－或－＋－－，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克（毫升）样品中大肠杆菌MPN值。
8、大肠菌群固体培养基测定法
8.1 样品制备同第4章。
8.2 计数
8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿1mL。
另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。
8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）10～15mL倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。
8.2.3 待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。
8.2.4 翻转平板，置于36±1℃培养18～24h。
8.2.5 选用有30～150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。
菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6 证实
8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24h和48h，观察产气情况。
8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。
对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7 结果报告
经最后证实为阳性（产气，革兰氏阴性杆菌）的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（毫升）样品中大肠菌群数。
例：
10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
100×6/10×10-4/g（mL）＝6.0×105/g（mL）
附 录A培养基和试剂（补充件）
A1 月桂基硫酸盐胰蛋白（胨）（LST）肉汤
胰蛋白（胨）或胰酪胨（Trypticase） 20g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾 2.75g
磷酸二氢钾 2.75g
月桂基硫酸钠 0.1g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。
分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH6.8±0.2。
A2 煌绿乳糖胆盐（BGAB）肉汤
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 200.0mL
0.1％煌绿水溶液 13.3mL
蒸馏水
将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，pH7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调pH7.4。
再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到20mm×150mm试管（管内有倒立的小发酵管）中，每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH7.2±0.1。
A3EC肉汤
胰蛋白（胨）或胰酪（胨）20.0g
3号胆盐或混合胆盐 1.5g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾 4.0g
磷酸二氢钾 1.5g
氯化钠 5.0g
蒸馏水 1000.0mL
将以上成分溶解于蒸馏水中，分装16mm×150mm试管（管内有倒立的小发酵管），每管8mL。
121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±0.1。
A4 伊红美蓝琼脂（EMB）
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
磷酸氢二钾2.0g
琼脂 15.0g
伊红γ（水溶性） 0.4g或2％水溶液20mL
美蓝 0.065g或0.5％水溶液13mL
蒸馏水 1000.0mL
在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。
分装于三角烧瓶中。
每瓶100mL或200mL，高压灭菌15min。
最终pH7.1±0.2。
使用前将琼脂融化，于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液，摇匀，冷至45～50℃倾注平皿。
A5 营养琼脂斜面
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解。
分装合适的试管。
121℃高压灭菌15min。
最终pH7.3±0.1。
灭菌后摆成斜面备用。
A6 色氨酸肉汤
胰胨或胰酪胨10.0g
蒸馏水1000.0mL
加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。
分装试管，每管5mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH6.9±0.2。
A7MR-VP培养基
（胨）胨 7.0g
葡萄糖 5.0g
磷酸氢二钾（K2HPO4） 5.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分溶于蒸馏水中，分装试管，121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±0.2。
A8Koser氏枸椽酸盐肉汤
磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·4H2O） 1.5g
磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0g
硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.2g
枸椽酸钠（含2H2O） 3.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。
最终pH6.7±0.2。
A9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）
蛋白胨 7.0g
酵母膏 3.0g
乳糖 10.0g
氯化钠 5.0g
胆盐或3号胆盐 1.5g
中性红 0.03g
结晶紫 0.002g
琼脂15～18g
蒸馏水 1000.0mL
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调至pH7.4±0.1。
煮沸2min，将培养基冷至45～50℃倾注平板。
临用时制备，不得超过3h。
A10Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液
贮存液 磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g
蒸馏水500mL
将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠约175mL调至pH7.2。
用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。
稀释液 取贮存液1.25mL，
用蒸馏水稀释至1000mL，分装于合适容器后，121℃高压灭菌15min。
A11生理盐水
氯化钠 8.5g
蒸馏水1000.0mL
将氯化钠溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
A12革兰氏染色液
结晶紫染色液：
结晶紫 1.0g
95％乙醇20.0mL
1％草酸铵水溶液80.0mL
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
革兰氏碘液：
碘 1.0g
碘化钾 2.0g
蒸馏水300.0mL
将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
沙黄复染液：
沙黄 0.25g
95％乙醇10.0mL
蒸馏水90.0mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
染色法
a.将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。
b. 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
c.滴加95％乙醇脱色约15～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。
d. 滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。
结果：
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
A13Kovacs氏靛基质试剂
对二甲氨基苯甲醛 5.0g
戊醇75.0mL 盐酸（浓）25.0mL
将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。
A14甲基红指示剂
甲基红0.1g
95％乙醇300mL
将甲基红溶解于300mL乙醇中，加水稀释至500mL。
A15Voges-Proskauer（V-P）试剂
甲液
α-萘酚 5.0g
无水乙醇100.0mL 乙液
氢氧化钾40.0g 用蒸馏水加至100.0mL
附 录B1g检样中最近似值（MPN）表
阳性管数
阳性管数
0.1
0.01
0.001
0.1
0.01
0.001
0
0
0
＜3
2
0
0
9.1
0
0
1
3
2
0
1
14
0
0
2
6
2
0
2
20
0
0
3
9
2
0
3
26
0
1
0
3
2
1
0
15
0
1
1
6.1
2
1
1
20
0
1
2
9.2
2
1
2
27
0
2
3
12
2
1
3
34
0
2
0
6.2
2
2
0
21
0
2
1
9.3
2
2
1
28
0
2
2
12
2
2
2
35
0
2
3
16
2
2
3
42
0
3
0
9.4
2
3
0
29
0
3
1
13
2
3
1
36
0
3
2
16
2
3
2
44
0
3
3
19
2
3
3
53
1
0
0
3.6
3
0
0
23
1
0
1
7.2
3
3
1
39
1
0
2
11
3
0
2
64
1
0
3
15
3
0
3
95
1
1
0
73
3
1
0
43
1
1
1
11
3
1
1
75
1
1
2
15
3
1
2
120
1
1
3
19
3
1
3
160
1
2
0
11
3
2
0
93
1
2
1
15
3
2
1
150
1
2
2
20
3
2
2
210
1
2
3
24
3
2
3
290
1
3
0
16
3
3
0
240
1
3
1
20
3
3
1
460
1
3
2
24
3
3
2
1100
1
3
3
29
3
3
3
>1100
（补充件）使用三管法，接种量分别为0.1，0.01和0.001g。
注：
①本表采用3个稀释度[0.1g（mL）、0.01g（mL）和0.001g（mL）]，每个稀释度接种3管。
②表内所列检样量如改用1g（mL）、0.1g（mL）和0.01g（mL）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g（mL）、0.001g（mL）和0.0001g（mL）时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。
附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。
本标准主要参考美国公职分析化学家协会（AOAC）法定分析方法第14版第46章（1984年）。
中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准1993-05-01实施
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