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整理植物成分分析

实验一、分离鉴定植物组织中的氨基酸

目的意义

层析分离技术（或称色层分析技术）是一种物理分离技术，是利用混合物中各组分的物理化学性质（如吸附力、分子大小和形状、分子亲和力、分子极性、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，达到分离的目的。

根据层析方法所依据的理化性质的不同，层析技术可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、排阻层析、亲和层析等。

根据固定相支持剂的质地和形状等的不同，层析技术可分为纸层析、薄层层析、薄膜层析、柱层析等。

层析分离技术因其操作简便，不需要很复杂的设备，样品用量可大可小，故既可用于实验室的分离分析，又适用于工业生产中产品的分离制备。

它与光学仪器配合，可组成各种自动化分离分析仪器，进一步显示了层析分离技术的优越性。

在生化技术领域里，层析技术已成为一项最常用的分离分析方法。

此项技术可用于研究物质组成和分离纯化各种成分。

通常用于分离分析氨基酸、核苷酸、糖类、激素、维生素等成分。

其优点是能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质，设备简单，操作容易，样品用量少，结果较准确。

本实验目的在于掌握层析法的一般原理和操作技术，学会氨基酸的鉴定方法。

一、纸层析法

（一）原理

纸层析是分配层析的一种，即以分配系数的不同，使不同物质在不同相中不同程度地分配，从而达到分离的目的。

一种物质在不同的溶剂中具有不同的溶解度。

所谓分配系数就是一种溶质在两种存在于同一系统而相互不溶的溶剂中溶解达到动态平衡时，溶质在两相中的浓度比值，通常用

表示：

各种物质的分配系数在一定条件下是一个常数。

将两种溶剂中的一相用一种支持剂加以固定，称为固定相。

让另一相从这相上流过，称为流动相。

这样，分配系数可表示为：

纸层析是以滤纸作支持剂的分配层析。

层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。

由于滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸附22％左右的水，而与有机溶剂的亲和力很弱，它可以在纸的毛细管中流动。

因此，以水作固定相，而以与水不相溶的有机溶剂作流动相。

层析时，将滤纸的一端浸入展层剂中，有机溶剂就会连续不断地通过点有样品的原点处，使其中的溶质依据其本身的分配系数不断地在两相间进行分配。

分配的过程：

一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区，并进行重新分配，即一部分溶质从有机相又进入水相。

随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配，不断向前移动。

各种物质因其分配系数的不同，在两相间分配的数量就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，向前移动的速度快；而分配系数大的溶质在固定相中分配的数量多，移动的速度慢。

所以各种溶质在层析的过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。

溶质迁移的速度用迁移率表示，符号为

。

各种化合物在恒定的条件下，经层析后都有其一定的

值，即在层析图谱中有一定的位置。

借此可以达到分离和鉴定的目的。

决定

值的因素主要是分配系数，而分配系数受以下因素的影响：

1.物质极性的大小：

水的极性很强，一般极性强的物质容易进入水相，非极性的物质易进入有机溶剂中。

如侧链含极性基团的氨基酸易分配在水相中，

值较小，而侧链含非极性基团的氨基酸易分配在有机相中，

值较大。

2.滤纸的质地以及为水饱和的程度：

滤纸的质地必须均一，纯净，厚薄适当，具有一定的机械强度，层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。

3.溶剂的纯度、pH值和含水量：

pH值和含水量的改变可使氨基酸和展层剂的极性改变，

值也随之改变。

4.层析的温度和时间：

温度改变，使溶剂中有机相含水量改变，

值也改变。

当所有条件相同时，层析时间短，则

值小。

因此，层析过程中对以上影响因素要严格控制。

（二）实验材料、仪器与试剂

1.实验材料：

绿豆芽。

2.仪器：

吹风机、层析缸、培养皿、毛细管、针线、尺子、曲别针、新华1号滤纸等。

3.试剂：

（1）标准氨基酸溶液：

0.1％的赖氨酸（Lys）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）及上述各种氨基酸溶液等体积的混合液。

（2）展层剂及显色剂：

按正丁醇:

95％乙醇:

冰乙酸:

水＝4:

2配成展层剂后，再以其配成0.1％的水合茚三酮试剂。

（三）操作步骤

1.点样：

取新华1号滤纸一张，于距一端2cm处用铅笔画一道直线，并均匀分出11个点，其中8个点分别点8种标准氨基酸（各点4～5次），1个点点混合氨基酸（7～8次），2个点点样品（7～8次）。

样品的点法是掰开绿豆芽下胚轴，挤出一些汁液，用毛细管吸一些点样即可。

2.层析：

取大小合适的层析缸一个，其底部放上直径为10cm左右的培养皿。

向培养皿中加入约1.5cm深的展层剂，盖严，平衡20min。

将点好样的滤纸卷成筒状，用曲别针或针线缝合固定两点（注意不要使滤纸的两边重叠）。

将滤纸点样端朝下，点样面向外放入培养皿中，盖严层析缸，开始层析。

待展层剂前沿到达距上端3cm左右时（约4～5h），层析停止，取出滤纸，用铅笔画下前沿线。

3.显色：

用吹风机热风将滤纸吹干，其上的氨基酸便与展层剂中的显色剂——茚三酮发生颜色反应，显出蓝紫色斑点，其中脯氨酸显黄色。

4.分析：

用铅笔描绘出色斑轮廓，计算各样点的

值，依据

值及颜色与标准氨基酸比较，鉴定出各样点的氨基酸名称，并得出绿豆芽中所含游离氨基酸的种类。

二、薄层层析法

（一）原理

薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。

把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。

由于层析在薄层上进行故而得名。

是一种微量、快速的层析方法。

它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。

还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。

薄层层析的作用机理主要包括吸附、分配、离子交换和凝胶过滤等作用。

当样品组分在薄板上进行分离时，这几种作用产生不同的影响，究竟哪种作用为主，须视情况而定。

在吸附薄层层析中，因样品组分极性有差异，故不同组分与吸附剂和展层剂的亲和力就有差别，从而导致各组分在薄板上的移动距离不同，组分与吸附剂亲和力强的留在接近原点的位置；反之，组分与吸附剂亲和力弱的留在离原点较远的位置，即亲和力愈弱，移动愈远，于是样品中各组分就得到分离。

按照相似溶解相似规律，极性组分易溶于极性溶剂中；非极性组分则易溶于非极性溶剂中，因此在同一薄板上，不同极性化合物的组分在同一溶剂中的溶解度不同，溶解度愈大，移动的速度愈快；否则反之。

展层的过程即样品各组分得到分离的过程，它也是一个吸附，解析，再吸附，再解析的连续过程。

同一种物质具有相同的Rf值，不同物质有不同的Rf值，因而达到彼此被分离的目的。

然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，就可以鉴定样品中各种氨基酸的种类，从显色斑点颜色的深浅和大小可以确定氨基酸的含量。

（二）实验材料、仪器与试剂

1.实验材料：

绿豆芽。

2.仪器:

薄层涂布器、研钵、试管、烘箱、真空干燥器、微量注射器、玻璃缸、喷雾器等。

3.试剂：

（1）展开剂Ⅰ：

甲酸：

叔丁醇：

甲乙酮：

氨水：

水（5：

3：

1：

1，V／V）。

（2）展开剂Ⅱ：

异丙醇：

甲酸：

水（20：

1：

5，V／V）。

注意：

以上两种展开剂临用时配。

（3）0．5％茚三酮丙酮溶液。

（4）羧甲基纤维素或微晶纤维素。

（5）标准氨基酸（2mg／mL）。

（三）操作步骤

（1）薄层板制备：

称取10g微晶纤维素，加入20mL蒸馏水和2.5mL丙酮，研磨1min,用薄层涂布器涂布于干净的玻璃板上。

其厚度以300～500μm为适（比一般薄板厚一些），凉干后即可使用。

（2）样品液制备：

称取样品5mg，放入小试管中，加入5.7N盐酸（恒沸点盐酸）0.6mL。

在火焰上熔融封口后，置于110℃烘箱中水解24h。

取出，打开封口于真空干燥器中减压抽干，以去掉过多的盐酸，以稀氨水调节至Ph7左右，加入10％异丙醇最后达0.5mL，置于冰箱中备用。

（3）点样：

用微量注射器取样液5μlspl，滴加在距薄板下边2cm处，点样直径在2～3mm内为宜。

（4）展开：

将已点样的薄板，放入有展开剂Ⅰ的玻璃缸里，先进行碱向展开，当溶剂前沿到达10cm时（约60～80min），将薄板取出，冷风吹干。

再进行酸向展开，将薄板放入有展开剂Ⅱ的玻璃缸中，展开至距离原点10cm时，取出吹于。

（5）显色；以0.5％茚三酮液喷雾于薄层板上，喷得薄板湿润并无液滴流下。

将薄板吹干，有氨基酸的地方显出蓝紫色斑点，只有脯氨酸为黄色斑点。

用笔将斑点圈出或用描图纸复绘保存。

（6）标准氨基酸按上述步骤进行点样，展开显色。

各种氨基酸层析图谱

【附注】

1.点样时样点不要过大，直径以不超过5mm为宜，最好掌握在2～3mm。

每点一次，要等其干后再点下一次（可用吹风机吹干），以防样点直径过大。

2.毛细管不要乱用，以防将标样弄混。

3.手要洗凈，并注意拿着滤纸的上端，以防将纸面污染。

4.吹干时时间不宜过长，以免将样点吹糊。

5.为了定量还可以点上不同浓度的氨基酸标准液，供比较和确定样品中氨基酸的含量。

计算：

氨基酸含量（mg／kg）=[定容体积（mL）/样品（g）]×[相当标准氨基酸（μg）/滴样（mL）]

实验二蛋白质含量的测定

目的意义

蛋白质不仅是植物的结构物质（如生物膜），而且是植物的生理活性物质（如酶），同时也是植物的重要贮藏物质，是维持植物生命活动所必需的。

测定植物组织中及籽粒中蛋白质的含量，对于了解植物体中蛋白质代谢状况和农作物品种的品质有重要意义。

本实验目的是学习测定蛋白质含量的原理和方法。

一、改良双缩脲法

（一）原理

本法是延用已久的蛋白质含量快速测定法，常用于谷物蛋白质含量的测定。

双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）在碱性溶液中能与Cu2＋产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应”。

蛋白质分子中的肽键也能与Cu2＋发生双缩脲反应，即Cu2＋与肽键中失去氢原子的氮原子相结合而生成紫红色络合物（在550nm处有一吸收峰），其颜色深浅在一定范围内与蛋白质含量成正相关，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关，且络合物的颜色相当稳定。

（二）实验材料、仪器与试剂

1.实验材料：

谷物与豆类种子经风干、磨碎并过100目筛。

2.仪器：

分光光度计、恒温箱、康氏振荡器、离心机、天平、移液管、具塞三角瓶等。

3.试剂：

（1）50mmol·L-1KOH溶液

（2）双缩脲试剂：

量取蒸馏水920mL，加10mol·L-1KOH溶液10mL和25％酒石酸钾钠20mL，摇匀后在剧烈搅拌下加4％CuSO4溶液50mL，密封保存。

如有沉淀析出，则需重新配制。

（3）蛋白质标准溶液：

精确称取70℃下恒重的纯酪蛋白或牛血清白蛋白1.0000g，溶于50mmol·L-1KOH溶液中，定容至100mL，其浓度为10mg·mL-1，保存在冰箱中。

（三）操作步骤

1.标准曲线制作：

取6支干燥试管，编号后按下表添加试剂，摇匀后于25℃温箱中静置1h，使其充分显色。

然后在550nm波长下比色，读取消光值。

以消光值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

试管编号

标准蛋白溶液（mL）

50mmol·L-1KOH（mL）

蛋白质浓度（mg·mL-1）

双缩脲试剂（mL）

消光值

1.0

0.2

0.8

0.4

0.6

0.4

0.8

0.2

1.0

2.样品测定：

（1）将磨碎过筛的样品在80℃下烘至恒重，取出置于干燥器中冷却待用。

（2）称取烘干样品0.5～1g，放入干燥的三角瓶中，加入50mmol·L-1KOH溶液10mL，摇匀，相当于样品液10mL。

再加入双缩脲试剂40mL，加塞盖严，在振荡器上振荡10min，再于25℃温箱中保温显色1h，4000rpm离心10min，取上清液于550nm下比色，记录消光值。

（四）结果计算

式中：

为蛋白质含量（mg·g-1）；

为从标准曲线上查得蛋白质浓度（mg·mL-1）；

为样品液体积（mL）。

二、斐林（Folin）－酚法

（一）原理

本法是一种灵敏度极高的快速测定蛋白质含量的方法（测定范围为5～100μg），尤其适用于不溶性蛋白质含量的测定。

Folin－酚试剂由两部分组成：

试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物而呈蓝色反应。

由于蛋白质中存在含酚基的氨基酸，故也有此反应，其颜色深浅与蛋白质含量成正相关。

在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。

由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。

（二）实验材料、仪器与试剂

1.实验材料：

各种植物材料。

2.仪器：

分光光度计、分析天平、离心机、冷凝回流装置、容量瓶、具塞刻度试管、移液管等。

3.试剂：

（1）0.5MNaOH

（2）试剂甲：

称取10gNa2CO3、2gNaOH和0.25g酒石酸钾钠用蒸馏水溶解后定容至500mL，为A液；称取0.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）用蒸馏水溶解后定容至100mL，为B液。

每次使用前将A液50份与B液1份混合，即为试剂甲。

此混合液有效期1天。

（3）试剂乙：

在1.5L容积的磨口回流器中加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g及蒸馏水700mL，再加85％磷酸50mL、浓盐酸100mL充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10h。

回流结束后，加入硫酸锂150g、蒸馏水50mL及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，需再重复滴加液体溴数滴，继续沸腾15min），稀释至1000mL，过滤，滤液贮于棕色试剂瓶中。

使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol·L-1酸度。

（4）标准牛血清白蛋白溶液：

精确称取牛血清白蛋白25mg，加少量蒸馏水溶解后定容至100mL，其浓度为250μg·mL-1。

（三）操作步骤

1.标准曲线制作：

取6支试管，编号，按下表添加试剂，混合后于室温下放置10min，再各加0.5mL试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱），30min后于650nm波长下比色，记录消光值。

以消光值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

试管编号

标准牛血清白蛋白（mL）

蒸馏水（mL）

蛋白质浓度（μg·mL-1）

试剂甲（mL）

1.0

0.2

0.8

0.4

0.6

100

0.6

0.4

150

0.8

0.2

200

1.0

250

2.样品提取：

称取鲜样0.5～1.0g于研钵中，加蒸馏水2mL，研成匀浆，转入离心管，并用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，一并转入离心管，4000rpm离心20min。

弃去沉淀，上清液定容至10mL，即为待测液。

3.样品测定：

取待测液1mL放入具塞试管中，加入试剂甲5mL，混匀后放置10min，然后加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温下放置30min，于650nm波长下比色，记录消光值。

（四）结果计算

式中：

为蛋白质含量（mg·g-1）；

为从标准曲线上查得蛋白质浓度（μg·mL-1）；

为提取液总体积（mL）；

为样品重（g）。

【附注】

1.因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在pH≠10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。

2.还原物质、其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。

三、考马斯亮蓝G-250染色法

（一）原理

考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

该染料在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者吸收峰在465nm，后者在595nm。

在一定蛋白质范围内（0～1000μg·mL-1），蛋白质色素结合物在595nm波长下的消光值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该反应非常灵敏（比斐林－酚法还高4倍），可测微克级蛋白质含量，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的蛋白质定量法。

其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

（二）实验材料、仪器与试剂

1.实验材料：

小麦叶片及其他植物材料。

2.仪器：

分光光度计、离心机、药物天平、容量瓶、移液管、试管等。

3.试剂

（1）100μg·mL-1标准牛血清白蛋白溶液：

精确称取牛血清白蛋白10mg，溶于100mL蒸馏水中。

（2）考马斯亮蓝G-250试剂：

称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入100mL85％磷酸（W/V），最后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中。

此溶液在常温下可放置一个月。

（3）其他试剂：

90％乙醇、85％磷酸。

（三）操作步骤

1.标准曲线制作：

取6支试管，按下表添加试剂。

摇匀，放置2min后在595nm波长下比色，记录消光值。

以消光值为纵坐标，牛血清白蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。

试管编号

标准牛血清白蛋白（mL）

蒸馏水（mL）

蛋白质浓度（μg·mL-1）

考马斯亮蓝G-250（mL）

消光值

1.0

0.2

0.8

0.4

0.6

0.4

0.8

0.2

1.0

100

2.样品提取：

称取鲜样0.5～1.0g放入研钵中，加2mL蒸馏水研成匀浆，转移至50mL容量瓶中，再以蒸馏水分次洗涤研钵，收集于同一容量瓶中，用水定容至刻度，放置30min以充分提取，其间摇动几次。

然后过滤或离心，清液即为待测液。

3.样品测定：

吸取提取液1mL，放入试管中，加5mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分摇匀，放置2min后于595nm处比色，记录消光值。

（四）结果计算

式中：

为蛋白质含量（mg·g-1）；

为从标准曲线上查得蛋白质浓度（μg·mL-1）；

为提取液总体积（mL）；

为样品重（g）。

四、紫外吸收（UV）法

（一）原理

蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在280nm波长下具有最大光吸收。

由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的光吸收值是蛋白质的一种普遍性质。

在一定程度上，蛋白质溶液在280nm的吸光度与其浓度成正比，故可作定量测定。

核酸在紫外区（260nm）也有吸收，可通过校正加以消除。

（二）实验材料、仪器与试剂

1.实验材料：

小麦叶片及其他植物材料。

2.仪器：

紫外分光光度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、移液管、试管等。

3.试剂：

0.1mol·L-1pH7.0磷酸缓冲液

（三）操作步骤

1.样品提取：

称取鲜样0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10000rpm离心10min，上清液为待测液。

2.测定：

取适量的样品提取液，根据蛋白质浓度，用0.1mol·L-1pH7.0磷酸缓冲液适当稀释后，用紫外分光光度计分别在280nm和260nm波长下读取吸光度，以pH7.0磷酸缓冲液为空白调零。

（四）结果计算

式中：

为蛋白质浓度（mg·mL-1）；1.45和0.74为校正值；

为蛋白质溶液在280nm处的吸光度；

为蛋白质溶液在260nm处的吸光度；

为稀释倍数；

为样品重（g）。

实验三还原糖、总糖、可溶性糖含量的测定

还原糖和总糖含量测定：

一、目的意义

糖是植物组织中含量最丰富的化合物。

还原糖可以合成非还原性糖，非还原糖也可以分解成还原性糖。

测定植物组织中总糖及还原糖的含量，能帮助我们了解植物糖代谢状况。

本实验的目的是掌握还原糖和总糖定量测定的基本原理，学习3,5－二硝基水杨酸法测定糖含量的基本操作。

二、原理

各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使无还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。

在碱性条件下，还原糖与3,5－二硝基水杨酸共热，3,5－二硝基水杨酸被还原为3－氨基－5－硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。

如果在测定前先用盐酸对样品进行水解，所测得的即为总糖含量。

多糖水解时，在单糖残基上加了一分子水，因而在计算总糖时须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9即为实际的总糖量。

三、实验材料、仪器与试剂

1.实验材料：

面粉或其它植物材料。

2.仪器：

分光光度计、离心机（过滤法不用此设备）、扭力天平、恒温水浴、具塞刻度试管、大离心管或玻璃漏斗、烧杯、三角瓶、容量瓶、移液管等。

3.试剂

（1）1mg·mL-1葡萄糖标准液：

准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。

（2）3,5－二硝基水杨酸试剂：

将6.3g3,5－二硝基水杨酸和262mL2MNaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。

冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

（3）碘－碘化钾溶液：

称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。

（4）酚酞指示剂：

称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。

（5）6MHCl

（6）6MNaOH

四、操作步骤

（一）制作葡萄糖标准曲线

取7支25mL具塞刻度试管，按下表加入试剂。

摇匀，沸水浴加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL刻度，塞住管口，颠倒混匀（如用普通大试管，则向每管加入21.5mL蒸馏水，混匀）。

在540nm波长下，用1号管调零，分别读取各管的消光值。

以消光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

试管编号

葡萄糖标准液（mL）

蒸馏水（mL）

葡萄糖浓度（mg·mL-1）

3,5－二硝基水杨酸（mL）

消光值

2.0

1.5

0.2

1.8

0.1

1.5

0.4

1.6

0.2

1.5

0.6

1.4

0.3

1.5

0.8

1.2

0.4

1.5

1.0

0.5

1.5

1.2

0.8

0.6

1.5

（二）样品中还原糖和总糖含量的测定

1.样品中还原糖的提取：

准确称取3g食用面粉，放在100mL饶杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。

离心或过滤，用20mL蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在100mL容量瓶中，用蒸馏

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