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1、整理植物成分分析实验一、分离鉴定植物组织中的氨基酸目的意义层析分离技术（或称色层分析技术）是一种物理分离技术，是利用混合物中各组分的物理化学性质（如吸附力、分子大小和形状、分子亲和力、分子极性、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，达到分离的目的。根据层析方法所依据的理化性质的不同，层析技术可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、排阻层析、亲和层析等。根据固定相支持剂的质地和形状等的不同，层析技术可分为纸层析、薄层层析、薄膜层析、柱层析等。层析分离技术因其操作简便，不需要很复杂的设备，样品用量可大可小，故既可用于实验室的分离分析，又适用于工业生产中产品的分离制备。它与光学仪器配合

2、，可组成各种自动化分离分析仪器，进一步显示了层析分离技术的优越性。在生化技术领域里，层析技术已成为一项最常用的分离分析方法。此项技术可用于研究物质组成和分离纯化各种成分。通常用于分离分析氨基酸、核苷酸、糖类、激素、维生素等成分。其优点是能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质，设备简单，操作容易，样品用量少，结果较准确。本实验目的在于掌握层析法的一般原理和操作技术，学会氨基酸的鉴定方法。一、纸层析法（一）原理纸层析是分配层析的一种，即以分配系数的不同，使不同物质在不同相中不同程度地分配，从而达到分离的目的。 一种物质在不同的溶剂中具有不同的溶解度。所谓分配系数就是一种溶质在两种存在于同

3、一系统而相互不溶的溶剂中溶解达到动态平衡时，溶质在两相中的浓度比值，通常用表示：各种物质的分配系数在一定条件下是一个常数。将两种溶剂中的一相用一种支持剂加以固定，称为固定相。让另一相从这相上流过，称为流动相。这样，分配系数可表示为： 纸层析是以滤纸作支持剂的分配层析。层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。由于滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸附22左右的水，而与有机溶剂的亲和力很弱，它可以在纸的毛细管中流动。因此，以水作固定相，而以与水不相溶的有机溶剂作流动相。层析时，将滤纸的一端浸入展层剂中，有机溶剂就会连续不断地通过点有样品的原点处，使其中的溶质依据其本身的分配系数不断地在两相间进行分配。分配的

4、过程：一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区，并进行重新分配，即一部分溶质从有机相又进入水相。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配，不断向前移动。各种物质因其分配系数的不同，在两相间分配的数量就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，向前移动的速度快；而分配系数大的溶质在固定相中分配的数量多，移动的速度慢。所以各种溶质在层析的过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。 溶质迁移的速度用迁移率表示，符号为。 各种化合物在恒定的条件下，经层析后都有其一定的值，即在层析图谱中有一定的位置。借此可以达到分离和鉴定的目的。决定值的因素主要是分配系数，而分配系数受以下因素的影

5、响：1. 物质极性的大小：水的极性很强，一般极性强的物质容易进入水相，非极性的物质易进入有机溶剂中。如侧链含极性基团的氨基酸易分配在水相中，值较小，而侧链含非极性基团的氨基酸易分配在有机相中，值较大。2. 滤纸的质地以及为水饱和的程度：滤纸的质地必须均一，纯净，厚薄适当，具有一定的机械强度，层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。3. 溶剂的纯度、pH值和含水量：pH值和含水量的改变可使氨基酸和展层剂的极性改变，值也随之改变。4. 层析的温度和时间：温度改变，使溶剂中有机相含水量改变，值也改变。当所有条件相同时，层析时间短，则值小。因此，层析过程中对以上影响因素要严格控制。（二）实验材料、仪器与试

6、剂1. 实验材料：绿豆芽。2. 仪器：吹风机、层析缸、培养皿、毛细管、针线、尺子、曲别针、新华1号滤纸等。3. 试剂：（1） 标准氨基酸溶液：0.1的赖氨酸（Lys）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）及上述各种氨基酸溶液等体积的混合液。（2） 展层剂及显色剂：按正丁醇:95乙醇:冰乙酸:水4:1:1:2配成展层剂后，再以其配成0.1的水合茚三酮试剂。（三）操作步骤1. 点样：取新华1号滤纸一张，于距一端2cm处用铅笔画一道直线，并均匀分出11个点，其中8个点分别点8种标准氨基酸（各点45次），1个

7、点点混合氨基酸（78次），2个点点样品（78次）。样品的点法是掰开绿豆芽下胚轴，挤出一些汁液，用毛细管吸一些点样即可。2. 层析：取大小合适的层析缸一个，其底部放上直径为10cm左右的培养皿。向培养皿中加入约1.5cm深的展层剂，盖严，平衡20min。将点好样的滤纸卷成筒状，用曲别针或针线缝合固定两点（注意不要使滤纸的两边重叠）。将滤纸点样端朝下，点样面向外放入培养皿中，盖严层析缸，开始层析。待展层剂前沿到达距上端3cm左右时（约45h），层析停止，取出滤纸，用铅笔画下前沿线。3. 显色：用吹风机热风将滤纸吹干，其上的氨基酸便与展层剂中的显色剂茚三酮发生颜色反应，显出蓝紫色斑点，其中脯氨酸显黄

8、色。4. 分析：用铅笔描绘出色斑轮廓，计算各样点的值，依据值及颜色与标准氨基酸比较，鉴定出各样点的氨基酸名称，并得出绿豆芽中所含游离氨基酸的种类。 二、薄层层析法（一）原理 薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。薄层层析的作用机理主要包括吸附、分配、离子交换和凝胶过滤等作用。当样品组分在薄板上进行分离时，这几种

9、作用产生不同的影响，究竟哪种作用为主，须视情况而定。在吸附薄层层析中，因样品组分极性有差异，故不同组分与吸附剂和展层剂的亲和力就有差别，从而导致各组分在薄板上的移动距离不同，组分与吸附剂亲和力强的留在接近原点的位置；反之，组分与吸附剂亲和力弱的留在离原点较远的位置，即亲和力愈弱，移动愈远，于是样品中各组分就得到分离。按照相似溶解相似规律，极性组分易溶于极性溶剂中；非极性组分则易溶于非极性溶剂中，因此在同一薄板上，不同极性化合物的组分在同一溶剂中的溶解度不同，溶解度愈大，移动的速度愈快；否则反之。展层的过程即样品各组分得到分离的过程，它也是一个吸附，解析，再吸附，再解析的连续过程。同一种物质具有

10、相同的Rf值，不同物质有不同的Rf值，因而达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，就可以鉴定样品中各种氨基酸的种类，从显色斑点颜色的深浅和大小可以确定氨基酸的含量。（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：绿豆芽。2. 仪器:薄层涂布器、研钵、试管、烘箱、真空干燥器、微量注射器、玻璃缸、喷雾器等。3. 试剂：（1）展开剂：甲酸：叔丁醇：甲乙酮：氨水：水（5：3：1：1，VV）。（2）展开剂：异丙醇：甲酸：水（ 2 0：1：5，VV）。注意：以上两种展开剂临用时配。（3）05茚三酮丙酮溶液。（4）羧甲基纤维素或微晶纤维素。（5）标准氨基酸（2mgmL）。（三）操作步骤（1）

11、薄层板制备：称取10g微晶纤维素，加入20mL蒸馏水和2.5mL丙酮，研磨1min,用薄层涂布器涂布于干净的玻璃板上。其厚度以300500m为适(比一般薄板厚一些），凉干后即可使用。（2）样品液制备：称取样品5mg，放入小试管中，加入5.7N盐酸（恒沸点盐酸）0.6mL。在火焰上熔融封口后，置于110烘箱中水解24h。取出，打开封口于真空干燥器中减压抽干，以去掉过多的盐酸，以稀氨水调节至Ph7左右，加入10异丙醇最后达0.5mL，置于冰箱中备用。（3）点样：用微量注射器取样液5lspl，滴加在距薄板下边2cm处，点样直径在23mm内为宜。（4）展开：将已点样的薄板，放入有展开剂的玻璃缸里，先进

12、行碱向展开，当溶剂前沿到达10cm时（约6080min），将薄板取出，冷风吹干。再进行酸向展开，将薄板放入有展开剂的玻璃缸中，展开至距离原点10cm时，取出吹于。(5)显色；以0.5茚三酮液喷雾于薄层板上，喷得薄板湿润并无液滴流下。将薄板吹干，有氨基酸的地方显出蓝紫色斑点，只有脯氨酸为黄色斑点。用笔将斑点圈出或用描图纸复绘保存。（6）标准氨基酸按上述步骤进行点样，展开显色。各种氨基酸层析图谱【附注】1. 点样时样点不要过大，直径以不超过5mm为宜，最好掌握在23mm。每点一次，要等其干后再点下一次（可用吹风机吹干），以防样点直径过大。 2. 毛细管不要乱用，以防将标样弄混。3. 手要洗凈，并注

13、意拿着滤纸的上端，以防将纸面污染。4. 吹干时时间不宜过长，以免将样点吹糊。5. 为了定量还可以点上不同浓度的氨基酸标准液，供比较和确定样品中氨基酸的含量。计算：氨基酸含量（mgkg）=定容体积（mL）/样品（g）相当标准氨基酸(g)/滴样（mL）实验二 蛋白质含量的测定目的意义蛋白质不仅是植物的结构物质（如生物膜），而且是植物的生理活性物质（如酶），同时也是植物的重要贮藏物质，是维持植物生命活动所必需的。测定植物组织中及籽粒中蛋白质的含量，对于了解植物体中蛋白质代谢状况和农作物品种的品质有重要意义。本实验目的是学习测定蛋白质含量的原理和方法。一、改良双缩脲法（一）原理 本法是延用已久的蛋白质

14、含量快速测定法，常用于谷物蛋白质含量的测定。双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）在碱性溶液中能与Cu2产生紫红色的络合物，这一反应称为“双缩脲反应”。蛋白质分子中的肽键也能与Cu2发生双缩脲反应，即Cu2与肽键中失去氢原子的氮原子相结合而生成紫红色络合物（在550nm处有一吸收峰），其颜色深浅在一定范围内与蛋白质含量成正相关，而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关，且络合物的颜色相当稳定。（二）实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：谷物与豆类种子经风干、磨碎并过100目筛。2. 仪器：分光光度计、恒温箱、康氏振荡器、离心机、天平、移液管、具塞三角瓶等。3.试剂：（1）50mmolL-1 KOH

15、溶液（2）双缩脲试剂：量取蒸馏水920mL，加10molL-1 KOH溶液10mL和25酒石酸钾钠20mL，摇匀后在剧烈搅拌下加4CuSO4溶液50mL，密封保存。如有沉淀析出，则需重新配制。（3）蛋白质标准溶液：精确称取70下恒重的纯酪蛋白或牛血清白蛋白1.0000g，溶于50mmolL-1 KOH溶液中，定容至100mL，其浓度为10mgmL-1，保存在冰箱中。（三）操作步骤1. 标准曲线制作：取6支干燥试管，编号后按下表添加试剂，摇匀后于25温箱中静置1h，使其充分显色。然后在550nm波长下比色，读取消光值。以消光值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。试管编号123456标准蛋

16、白溶液（mL）50mmolL-1 KOH（mL）蛋白质浓度（mgmL-1）双缩脲试剂（mL）消光值01.0040.20.8240.40.6440.60.4640.80.2841.001042. 样品测定： （1）将磨碎过筛的样品在80下烘至恒重，取出置于干燥器中冷却待用。（2）称取烘干样品0.51g，放入干燥的三角瓶中，加入50mmolL-1 KOH溶液10mL，摇匀，相当于样品液10mL。再加入双缩脲试剂40mL，加塞盖严，在振荡器上振荡10min，再于25温箱中保温显色1h，4000rpm离心10min，取上清液于550nm下比色，记录消光值。（四）结果计算式中：为蛋白质含量（mgg-1）

17、；为从标准曲线上查得蛋白质浓度（mgmL-1）；为样品液体积（mL）。二、斐林（Folin）酚法（一）原理 本法是一种灵敏度极高的快速测定蛋白质含量的方法（测定范围为5100g），尤其适用于不溶性蛋白质含量的测定。Folin酚试剂由两部分组成：试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应；试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物而呈蓝色反应。由于蛋白质中存在含酚基的氨基酸，故也有此反应，其颜色深浅与蛋白质含量成正相关。在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。（二）实

18、验材料、仪器与试剂1. 实验材料：各种植物材料。2. 仪器：分光光度计、分析天平、离心机、冷凝回流装置、容量瓶、具塞刻度试管、移液管等。3. 试剂：（1）0.5M NaOH（2）试剂甲：称取10g Na2CO3、2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠用蒸馏水溶解后定容至500mL，为 A液；称取0.5g硫酸铜（CuSO45H2O）用蒸馏水溶解后定容至100mL，为B液。每次使用前将A液50份与B液1份混合，即为试剂甲。此混合液有效期1天。（3）试剂乙：在1.5L容积的磨口回流器中加入钨酸钠（Na2WO42H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO42H2O）25g及蒸馏水700mL，再加85磷酸50

19、mL、浓盐酸100mL充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入硫酸锂150g、蒸馏水50mL及数滴液体溴，开口继续沸腾15min ，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，需再重复滴加液体溴数滴，继续沸腾15min），稀释至1000mL，过滤，滤液贮于棕色试剂瓶中。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1molL-1酸度。（4）标准牛血清白蛋白溶液：精确称取牛血清白蛋白25mg，加少量蒸馏水溶解后定容至100mL，其浓度为250gmL-1。（三）操作步骤1. 标准曲线制作：取6支试管，编号，按下表添加试剂，混合后于室温下放置10min，再各加0.5mL试剂乙，立即混合均

20、匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱），30min后于650nm波长下比色，记录消光值。以消光值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。试管编号123456标准牛血清白蛋白（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（gmL-1）试剂甲（mL）01.0050.20.85050.40.610050.60.415050.80.220051.0025052. 样品提取：称取鲜样0.51.0g于研钵中，加蒸馏水2mL，研成匀浆，转入离心管，并用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，一并转入离心管，4000rpm离心20min。弃去沉淀，上清液定容至10mL，即为待测液。3. 样品测定：取待测液1mL放入具塞试管中，加

21、入试剂甲5mL，混匀后放置10min，然后加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温下放置30min，于650nm波长下比色，记录消光值。（四）结果计算式中：为蛋白质含量（mgg-1）；为从标准曲线上查得蛋白质浓度（gmL-1）；为提取液总体积（mL）；为样品重（g）。【附注】1. 因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在pH10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。2. 还原物质、其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。三、考马斯亮蓝G-250染色法（一）原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brillian

22、t blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者吸收峰在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质范围内（01000gmL-1），蛋白质色素结合物在595nm波长下的消光值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡，其结合物在室温下1h 内保持稳定。该反应非常灵敏（比斐林酚法还高4倍），可测微克级蛋白质含量，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的蛋白质定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。（二）实验材料、仪

23、器与试剂1. 实验材料：小麦叶片及其他植物材料。2. 仪器：分光光度计、离心机、药物天平、容量瓶、移液管、试管等。3. 试剂（1）100gmL-1标准牛血清白蛋白溶液：精确称取牛血清白蛋白10mg，溶于100mL蒸馏水中。（2）考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入100mL 85磷酸（W/V），最后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中。此溶液在常温下可放置一个月。（3）其他试剂：90乙醇、85磷酸。（三）操作步骤1. 标准曲线制作：取6支试管，按下表添加试剂。摇匀，放置2min后在595nm波长下比色，记录消光值。以消光值为纵坐标，牛

24、血清白蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。试管编号123456标准牛血清白蛋白（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（gmL-1）考马斯亮蓝G-250（mL）消光值01.0050.20.82050.40.64050.60.46050.80.28051.0010052. 样品提取：称取鲜样0.51.0g放入研钵中，加2mL蒸馏水研成匀浆，转移至50mL容量瓶中，再以蒸馏水分次洗涤研钵，收集于同一容量瓶中，用水定容至刻度，放置30min以充分提取，其间摇动几次。然后过滤或离心，清液即为待测液。3. 样品测定：吸取提取液1mL，放入试管中，加5mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分摇匀，放置2min后于595nm

25、处比色，记录消光值。（四）结果计算式中：为蛋白质含量（mgg-1）；为从标准曲线上查得蛋白质浓度（gmL-1）；为提取液总体积（mL）；为样品重（g）。四、紫外吸收（UV）法（一）原理蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在280nm波长下具有最大光吸收。由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的光吸收值是蛋白质的一种普遍性质。在一定程度上，蛋白质溶液在280nm的吸光度与其浓度成正比，故可作定量测定。核酸在紫外区（260nm）也有吸收，可通过校正加以消除。（二）实验材料、仪器与试剂 1. 实验材料：小麦叶片及其他植物材料。 2. 仪器：紫外分光光度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、移液管、试管

26、等。 3. 试剂：0.1molL-1 pH 7.0磷酸缓冲液（三）操作步骤 1. 样品提取：称取鲜样0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10000rpm离心10min，上清液为待测液。 2. 测定：取适量的样品提取液，根据蛋白质浓度，用0.1molL-1 pH 7.0磷酸缓冲液适当稀释后，用紫外分光光度计分别在280nm和260nm波长下读取吸光度，以pH 7.0磷酸缓冲液为空白调零。（四）结果计算式中：为蛋白质浓度（mgmL-1）；1.45和0.74为校正值；为蛋白质溶液在280nm处的吸光度；为蛋白质溶液在260nm处的吸光度；为稀释倍数；为样品重（g）。实验三 还原糖、总糖、可

27、溶性糖含量的测定还原糖和总糖含量测定：一、目的意义糖是植物组织中含量最丰富的化合物。还原糖可以合成非还原性糖，非还原糖也可以 分解成还原性糖。测定植物组织中总糖及还原糖的含量，能帮助我们了解植物糖代谢状况。本实验的目的是掌握还原糖和总糖定量测定的基本原理，学习3,5二硝基水杨酸法测定糖含量的基本操作。二、原理各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使无还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。在碱性条件下，还原糖与3,5二硝基水杨酸共热，3,5二硝基水杨酸被还原为3氨基5硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化

28、成糖酸及其他产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。如果在测定前先用盐酸对样品进行水解，所测得的即为总糖含量。多糖水解时，在单糖残基上加了一分子水，因而在计算总糖时须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9即为实际的总糖量。三、实验材料、仪器与试剂1. 实验材料：面粉或其它植物材料。2. 仪器：分光光度计、离心机(过滤法不用此设备)、扭力天平、恒温水浴、具塞刻度试管、大离心管或玻璃漏斗、烧杯、三角瓶、容量瓶、移液管等。3. 试剂（1）1mgmL-1葡萄糖标准液：准确称取

29、100mg分析纯葡萄糖（预先在80烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。（2）3,5二硝基水杨酸试剂：将6.3g 3,5二硝基水杨酸和262mL 2M NaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。（3）碘碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。（5）6M HCl（6）6M NaOH四、操作步骤（一）制作葡萄糖标准曲线取7

30、支25mL具塞刻度试管，按下表加入试剂。摇匀，沸水浴加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL刻度，塞住管口，颠倒混匀（如用普通大试管，则向每管加入21.5mL蒸馏水，混匀)。在540nm波长下，用1号管调零，分别读取各管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。试管编号1234567葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）葡萄糖浓度（mgmL-1）3,5二硝基水杨酸（mL）消光值02.001.50.21.80.11.50.41.60.21.50.61.40.31.50.81.20.41.51.01.00.51.51.20.80.61.5（二）样品中还原糖和总糖含量的测定1. 样品中还原糖的提取：准确称取3g食用面粉，放在100mL饶杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50mL蒸馏水，搅匀，置于50恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。离心或过滤，用20mL蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在100mL容量瓶中，用蒸馏