组培.docx

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组培

绪论

•细胞工程与生物技术

•细胞工程的概念及其研究内容

•植物组织培养的研究内容及其技术

•植物组织培养的发展历史

•植物组织培养的应用及发展趋势

一、细胞工程与生物技术（Biotechnology）

1生物技术

生物技术：

指应用自然科学和工程原理，依靠动物、植物、微生物为反应器，将物料加工以提供产品来为社会服务。

2发展阶段

传统生物

现代生物技术

特点：

是综合性学科，涉及多个领域的技术，采用先进的方法，设备、仪器和手段

3.研究内容

•蛋白质工程

•细胞工程

•基因工程

•酶工程

•发酵工程

•生化工程、基因组学蛋白质组学

•生物芯片

•生物信息学、海洋生物技术、太空生物技术

二、细胞工程的概念及其研究内容

1细胞工程（Cellengineering）

细胞工程：

指在细胞水平上研究、开发和利用各种细胞的工程。

具体是指应用现代生物学、细胞学、遗传学、生物化学、分子生物学和细胞生物学的方法和技术，对细胞进行遗传操作及离体培养，以改良品种，生产有用的生物产品或原料。

2细胞工程的研究内容

（1） 植物细胞工程（植物组织培养）

（2） 动物细胞工程

（3） 微生物细胞工程

三、植物组织培养的研究内容及其技术

1植物组织培养的概念

植物组织培养，又称“植物的离体培养技术”，“植物的器官、组织和细胞培养技术”，指通过细胞或非细胞水平上的离体培养，细胞融合、遗传物质的改造或修饰等技术来改良植物品种或生产有用物质。

2.植物组织培养的研究内容

•植物细胞与组织培养（Plantcellandtissueculture）

•植物细胞融合（Plantprotoplastfusionandsomatichybridization）

•植物细胞质工程（PlantCytoplasmengineering）

•植物染色体与染色体组工程（Plantchromosomeengineeringandplantgenomeengineering）

•植物细胞核与细胞器的移植（plantnucleusandorganelletransplantation）

（1）植物细胞与组织培养技术

植物细胞与组织培养技术：

指在无菌条件下，将离体的植物器官、细胞、组织或完整个体，在人工控制的条件下进行培养，使之成为完整的植物体。

外植体（explant）：

从活体植物上切取下来，进行培养的那一部分组织或器官均称为外植体。

•器官培养（Organculture）

•胚胎培养（Embryoculture）

•组织培养（Tissueculture）

•细胞培养（Cellculture）

•原生质体培养（Protoplasmculture）

（2）植物原生质体融合和体细胞杂交

指将两种异源的原生质体，在诱导剂诱发下相互接触，从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞，进一步发育成杂种植物体，称为细胞融合。

3.植物组织培养技术

•基本的无菌操作技术

•器官培养技术

•胚胎培养技术

•组织培养技术

•细胞培养技术

•原生质体培养与体细胞杂交技术

•单倍体育种技术

•突变体筛选技术

•体细胞胚胎的发生及人工种子

•细胞遗传转化与转基因植物的鉴定

•细胞培养物的形态和细胞学观察

•细胞、组织培养物的超低温保存

四、植物组织培养的发展历史

•探索阶段

•技术建立阶段

•技术与理论的发展时期

•快速发展和实践应用阶段

五.植物组织培养的应用及发展趋势

•快速繁殖方面

•苗木脱毒技术

•次生代谢物质的生产

•培育体细胞杂种

•培育人工种子

•种质保存

•基因工程

•突变体育种

•遗传学、分子生物学、病理学等基础研究方面的应用

参考书目

•植物组织培养教程李浚明编著

•植物细胞工程林顺全编著

•植物细胞工程实验技术孙敬三

•实用植物组织培养教程曹孜义主编

•细胞培养司徒镇强编著

•花卉组织培养韦三立编著

参考期刊

•植物生理学通讯

•植物学报

•实验生物学报

•植物生理学报

第一章植物组织培养实验室及基本操作技术

第一节：

植物组织培养实验室

一、实验室的设计

植物细胞工程的实验室有化学实验室、无菌室、培养室、细胞学实验室、摄影室、灭菌室等，（如下图）

1、化学实验室

用途：

药物放置、称取、配制、仪器存放、洗涤、干燥、灭菌、培养基配制、消毒、制蒸馏水、接种材料：

准备、培养

要求：

干净、便于工作

放置的仪器：

药物柜、天平、烘箱、培养箱、高压灭菌器、无离子水发生器、蒸馏水器、水槽、电炉、

2、无菌操作室

用途：

接种外植体、转移培养物，原生质体的游离、放灭菌后用的培养基。

要求：

关键保持较长时间无菌状态。

要做到以下几点：

墙壁地面光滑平整无缝隙；

空气不对流，空气净化后入室内，一天换一次空气或装排气扇；

控制温度；

装日光灯照明，紫外光灯消毒，工作台装紫外灯消毒。

设缓冲间

作用：

防工作人员带入杂菌，约2㎡即可。

设洗手池、装消毒液、衣架，供工作人员换衣、鞋、帽、口罩。

定期消毒：

2%新洁尔灭溶液擦地板，每天甲醛、KMnO4消毒。

设置：

培养架：

放灭菌后待接种的培养基；

照明灯、消毒紫外光、排气扇。

超净工作台或接种箱，接种箱有单人、

3、培养室

用途：

离体组织、原生质体和试管苗生

长发育的场所，相当于作物的大田。

要求：

墙壁地面光滑保温、保湿，窗装双层

玻璃透光保温，顶高2.6m易控温湿；

恒温灯25℃--27℃,日光灯照明；

保持干燥清洁：

定期2%新洁尔灭溶液消毒，

定期熏蒸，喷70%酒精降尘。

双人操作两种。

（如图2）

设置：

光培养室：

培养物上方装日光灯，用于分化培养。

暗培养室：

用于诱导培养或紫外检测。

培养架：

用于固体培养，用3*3cm或2.5*2.5cm万用角铁搭成4—6层，最低一层离地40cm左右，每层间隔30cm，一般1.3m长，宽50cm，每层装2支40w日光灯。

摇床、转床

4、细胞学实验室

用途：

观察组培过程

普通显微摄影

细胞学、形态学解剖

切片、制片观察

要求：

洁净、干燥、明亮，台面平整稳固。

设施：

体视显微镜（图）倒置显微镜摄影装置解剖镜图切片机染色设备

5、摄影室

6、灭菌室

用途：

器皿、培养基高温高压灭菌、消毒、制蒸馏水。

要求：

防潮、耐高温、室内排供水良好，通气、易排蒸气、热量。

设备：

水、电、煤气、高温高压消毒仪器、制蒸馏水器。

二、仪器设备及玻璃器皿

1、仪器设备:

A、天平

B、烘箱

C、恒温箱

D、冰箱

E、酸度计

F、超净工作台

使用：

台面摆放接种工具。

G、灭菌器：

有手提式、立体和卧式三种。

H、离心机

I、显微镜及显微摄影

J、摇床和转床

2、玻璃器皿和用具:

A、玻璃器皿：

种类多、规格多

常用的有：

三角瓶、容量瓶、试管、培养皿、量筒、吸管、烧杯等。

第二节无菌操作技术

一、清洗

1. 玻璃器皿的清洗

洗涤顺序：

去除油渍、培养基、霉菌等脏物

↓

洗衣粉或洗洁精洗刷，使内壁不挂水珠

↓

清水冲洗数次

↓

晾、烘干备用

二、消毒灭菌

（一）常用的消毒灭菌方法及其使用范围：

物理灭菌：

高温高压灭菌（湿热灭菌）

干热灭菌

射线辐射

过滤灭菌

化学灭菌：

熏蒸灭菌

消毒液灭菌（酒精、氯化汞、次氯酸钠（钙）溶液）。

（二）灭菌

1. 培养材料的灭菌

a.  茎尖、茎段及叶片等材料的灭菌

b.果实及种子的灭菌

c.花药灭菌

d.根及地下器官的灭菌

2.培养基的灭菌

培养基的灭菌常用的方法有两种，

a.高压蒸汽灭菌:

适用于固体培养基的灭菌

b.过滤灭菌：

适用于液体培养基的灭菌

使用高压蒸汽灭菌锅灭菌应注意：

Ⅰ：

高压蒸汽灭菌锅不可过满。

Ⅱ：

锅内冷空气必须排尽。

Ⅲ：

锅内达到一定压力后，注意在保持压力的过程中，严遵守时间。

Ⅳ：

三角瓶中的液体不超过总体积的70%。

三、接种

1.接种操作过程：

新洁尔灭溶液拖地板甲醛、高锰酸钾熏蒸工作前开紫外光灯20分钟开动超净台10—5分钟新洁尔灭洗手，70%酒精擦手擦超净台面点燃酒精灯烧培养瓶口灭菌烧工具酒精灯上无菌区内接种烧瓶口盖上盖。

2.注意事项：

a.无菌操作室（接种室）

b.接种台

c.工作人员。

d.当接种打开包头纸时，注意不要污染瓶口。

第三节培养基的成分及配制方法

一、培养基的成分及其作用

组成：

水

无机营养：

大量元素

微量元素

有机营养：

碳源

维生素

氨基酸

植物激素

天然提取物

琼脂

其它：

活性炭、抗生素、

抗酚类物质污染的添加剂、

生长抑制剂、染色剂……

注意：

不同培养基无机盐浓度相差有的高达10倍；

高浓度无机盐保证组织生长需要的矿质营养，使生长加快；

生根要求无机盐浓度低些。

植物激素的应用规律。

Ø先生长素处理，后细胞分裂素处理，有利于细胞分裂，但细胞不分化，容易产生多倍体细胞（核分裂和胞壁分裂不同步所致），细胞分裂素有利于胞壁形成。

Ø先细胞分裂素处理，后生长素处理、细胞分裂也分化（可能是内源生长素起了作用）。

Ø生长素/细胞分裂素：

比值高时，有利于根分化，抑制芽形成。

比值低时，有利芽分化，抑制根形成。

比值适中时，促进愈伤组织生长。

二、培养基的种类及成分

Ø按培养基状态来分有固体、液体；

Ø按培养基配方分有：

MS、N6、WhiteNitsch

Ø按主要试验目的来分有诱导、分化、继代、生根；

Ø按培养基处理不同有条件培养基、看护培养基等。

Ø根据培养基中无机盐的含量可分为4类

1、按培养基状态分：

固体、液体培养基。

固体培养基：

加入琼脂或卡拉胶，使培养基成凝固状态，

作用；它可以支持培养物.

优点：

通气性好，便于观察，操作简便。

缺点是：

培养物与培养基接触小；

培养物排出代谢废物，聚集在吸收表面上；

培养物生长速度低于液体培养。

液体培养基：

不加琼脂或固化剂

2、按培养基配方来分：

培养基种类很多，常用的配方有MS、N6、WhiteNitsch。

MS、Nitsch：

培养基中无机盐浓度高。

高浓度无机盐利于保证组织生长所需矿质营养，愈伤组织生长快，在贮存配制消毒过程中不因某成分略有出入影响培养基离子平衡。

White：

无机盐浓度较低，适合生根培养。

N6：

适于禾谷类作物。

3、按试验目的分：

•诱导培养基

•分化培养基

••继代培养基

•生根培养基

4.根据培养基中无机盐的含量可分为4类

•高盐成分培养基（MS培养基；LS培养基；BL培养基；BH培养基；ER培养基）

•硝酸盐含量较高的培养基（B5培养基：

N6培养基；LH培养基）

•中等无机盐类培养基（H培养基；尼齐培养基；Miller培养）

•低无机盐培养基（改良White培养基；Knop培养基；HB培养基）

特有培养基（NT培养基；RB-8培养基；氨基酸培养基；RM培养基WPM培养基；C17培养基；SH培养基）

三、培养基的制备

1培养基母液的配制

将培养基配方中的各种药物，或单独或混合配成浓度较高的溶液，一般配10—100倍母液放冰箱存放备。

好处：

减少称药麻烦；

减少微量元素用药称量误差。

注意：

浓度高耐贮存，但准确度低，浓度过低不耐贮，易长绿藻；避免不恰当混合引起沉淀。

•大量元素母液配制（10χ1000ML）

•微量元