蛋白质工程复习题.docx

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蛋白质工程复习题

蛋白质工程复习题

名词解释

结构域：

生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，特别指蛋白质中这样的区域

基因突变：

基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象

融合蛋白：

将两个或多个开放阅读框按一定序列顺序连接，融合阅读框表达出一杂合蛋白。

蛋白的表达模式:

蛋白质的分子设计：

构型：

是一个分子中原子的特定空间排布。

构型改变必须有共价键的断裂和重新形成。

最基本的分子构型为L-型和D-型，这种异构体在化学上可以分离。

构象：

组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布。

构象改变,无共价键的断裂和重新形成，化学上难于区分和分离

α-氨基酸：

原核表达：

是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达

蛋白质的二级结构：

在一段连续的肽单位中具有同一相对取向，可以用相同的构象角来表征，构成一种特征的多肽链线性组合。

结构域：

二级结构和结构模体以特定的方式组合连接，在蛋白质分子中形成2个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域。

蛋白质的三级结构：

结构域在三维空间中以专一的方式组合排布,或者二级结构、结构模体及其与之相关联的各种环肽链在空间中的进一步协同盘曲、折叠，形成包括主链、侧链在内的专一排布。

蛋白质分子的四级结构：

指蛋白质分子的亚基结构（subunit），亚基的数目、类型、空间排布方式和亚基间相互作用的性质，构成四级结构的基本内容。

亚基：

许多蛋白质作为完整的活性分子，是由两条以上的多肽链组成，它们各自以独特的一级、二级、三级结构相互以非共价作用联结，共同构成完整的蛋白质分子，这些肽链单位称为亚基。

其聚合整体称为寡聚体

蛋白质的分子设计：

从蛋白质分子水平上通过数据库等大量实验数据，结合现代的理论方法通过计算机设计新的分子。

分子伴侣：

一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份

启动子：

由核苷酸组成，本身并不控制基因活动而是通过与转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的

增强子：

能强化转录起始的一段DNA序列为增强子或强化子

乳糖操纵子：

是参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。

双特异性抗体：

是指能同时识别2种抗原的抗体。

1种为对应肿瘤相关抗原。

另1种为对应效应成分

蛋白质工程：

以蛋白质分子的结构与功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。

抗体酶：

一类具有催化能力的免疫球蛋白。

简答题

一．简述蛋白质工程研究的基本途径。

1.1蛋白质结构分析（研究核心）

1）收集大量的蛋白质分子结构的信息；2）建立结构与功能之间关系的数据；3）蛋白质结构与功能之间关系的理论研究。

主要技术：

晶体学技术（x射线晶体结构分析）、多维核磁共振波谱技术

1.2结构预测

对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能；根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。

主要技术：

分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。

1.3创造和改造蛋白质

1）物理、化学法：

对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等

2）生物化学法：

使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等

3）基因重组技术或人工合成DNA：

可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。

二．欲使目的蛋白在大肠杆菌中表达，则表达载体的一般特点是什么？

1）复制起始点2）选择性基因3）强的、可诱导的启动子4）强的转录终止序列5）核糖体结合位点6）合适的多克隆位点

三．简述X射线晶体衍射技术测定蛋白质晶体结构的具体步骤。

培养大的、质量好的晶体；进行初步的x射线衍射分析；重原子衍生物的制备；衍射数据的测量和处理；相位的计算；电子密度图的计算和解释；分子模型的修正。

四．列举两种常见蛋白质晶体结构测定方法及讨论其优缺点。

晶体结构：

X－射线

优点：

能快速、精细、直观地表达出分子内各基团的相互空间关系

缺点：

不是所有的生物大分子都能够获得良好的结晶；所得到的晶体往往是分子处于基态,而分子功能的行使多发生在激发态，很难捕捉到分子的功能状态

溶液结构：

核磁共振（NMR）

优点：

是对X-射线晶体衍射的补充，分辨率仅次于X-射线晶体技术，可以在溶液中操作，接近生理状态

缺点：

蛋白质的分子量要比较小，一般在50KD以下，分子量越大所测到的谱线就越多，有时各谱线很难分辨。

五．简述蛋白质在生物体内的形成的过程

蛋白质在体内的形成分为两个阶段：

第一阶段：

在遗传密码指导下，将氨基酸按特定序列在核糖体上连接起来，形成只有一级结构（氨基酸序列）的多肽链，称为多肽链的生物合成。

第二阶段：

合成的多肽链，以现在尚不清楚的机制自动折叠成为特定的三维结构，形成具有完整结构和功能的蛋白质分子，称为新生肽链折叠（或蛋白质折叠）

六．蛋白质分子设计的步骤是什么？

1）建立所研究蛋白质的结构模型

2）找出对所要求的性质有重要影响位置

3）悬着一系列的在2）中所选出的位点上改变残基所得到的突变体，一方面使蛋白质可能具有所要求的性质，另一方面又尽量维持原有结构，使其不做大的变动

4）预测突变体的结构

5）定性或定量计算优化所得到的突变体结构是否具有所要求的性质。

七．简述目的蛋白原核表达的基本步骤。

（1）、制备表达载体：

酶切,去磷酸化；胶回收纯化

（2）、制备目的DNA：

质粒纯化/PCR；酶切；胶回收纯化

（3）、将目的DNA克隆到载体上：

目的片断与载体连接、转化非表达型宿主菌、筛选阳性克隆:

菌落PCR,质粒提取酶,测序确定阅读框

（4）、转化表达宿主菌：

转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株

（5）、诱导优化表达目的蛋白：

检测质粒稳定性、确定表达时间和温度的最佳条件、分析蛋白溶解性和活性、SDS-PAGE,Western印迹等确定目的蛋白

（6）、纯化目的蛋白：

放大培养、制备粗提物、亲和纯化、切除融合标签并去除蛋白酶

八．蛋白质分子设计的步骤是什么？

1.建立所研究蛋白质的结构模型；2.找出对所要求的性质有重要影响的位置；3.选择一系列的在

（2）中所选出位点上改变残基所得到的突变体；4.预测突变体的结构；5.定性或定量计算优化所得到的突变体结构是否具有所要求的性质。

九．简述大肠杆菌中表达体系的优缺点?

大肠杆菌中表达体系的优点:

大肠杆菌表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。

利用大肠杆菌作为表达体系的优点：

遗传学和生理学背景清楚；容易培养，特别是高密度发酵；外源基因经常可以达到高效表达。

大肠杆菌表达体系的缺点:

大肠杆菌系统最大的不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰，如糖基化、烷基化、磷酸化、特异性的蛋白水解加工等；而广泛二硫键的形成以及外源蛋白质组装成多亚基复合体的能力也受到限制。

大肠杆菌体系的另一个不足之处是外源基因产物在大肠杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常依然保留在蛋白质的N末端。

最后，由于真核mRNA的结构特性以及密码子使用频率与大肠杆菌本身的差异，当用真核mRNA的序列直接在大肠杆菌细胞中表达时，有时不能得到足够的产物。

酶工程复习资料

酶的定向进化：

模拟自然进化过程（随机突变+自然选择），在体外对酶基因进行人工随机突变，建立突变基因库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有预先期望的具有某些特性的酶的突变体的技术过程。

酶反应器：

用于完成酶促反应的核心装置。

它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。

它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。

超临界流体：

指温度和压力超过某物质超临界点的流体

盐析：

在盐浓度达到一定界限时，酶的溶解度随盐的浓度升高而降低。

必需水：

维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。

离子液体：

由有机阳离子与有机阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低，稳定性好

酶的定义：

酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。

离心分离：

借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。

酶的分类：

氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶

提高酶产量的措施：

添加诱导物（酶的作用底物、酶的催化反应产物、作用底物的类似物）、控制阻遏物的浓度（产物阻遏作用、分解代谢物阻遏作用）、添加表面活性剂、添加产酶促进剂

酶的生产方法：

提取分离法、生物合成、化学合成

培养基的五大要素：

碳源、氮源、无机盐、生长因子、水

酶生物合成的模式分为4种类型：

同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型

酶生物合成模式：

同步合成型，中期合成型，延续合成型，滞后合成型

离心机的分类及选择

低速离心机：

主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。

也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。

高速离心机：

用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。

超速离心机：

用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。

易错PCR技术

原理：

从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。

优点：

简便，随机突变丰富；缺点：

正突变率低，突变基因文库大，筛选工作量大；适用于较小基因的定向进化

酶固定化

概念：

采用各种方法，将酶固定在水不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程称为酶的固定化。

固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。

方法：

吸附法、包埋法、交联法、热处理法

应用：

运用于工业化生产、酶传感器、酶电极

问答题

一．如何提高酶的产量?

答：

a、添加诱导物：

对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。

b、控制阻遏物的浓度：

阻遏作用根据机理不同，可分为：

产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。

产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。

分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。

c、添加表面活性剂：

表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。

d、添加产酶促进剂：

产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。

二．细胞破碎的方法及原理。

a、机械破碎法：

捣碎法，研磨法，匀浆法。

原理：

通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎；

b、物理破碎法：

温度差破碎法，压力差破碎法，超声波破碎法。

原理：

通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎；

c、化学破碎法：

添加有机溶剂（甲苯、丙酮、丁醇、氯仿），添加表面活性剂。

原理：

通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞破碎；

d、酶促破碎法：

自溶法，外加酶制剂法。

原理：

通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎

三．酶分子修饰的意