气相色谱与液相色谱.docx

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气相色谱与液相色谱

一、分离原理：

1.气相：

气相色谱是一种物理的分离方法。

利用被测物质各组分在不同两相间分配系数（溶解度）的微小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行反复多次的分配，使原来只有微小的性质差异产生很大的效果，而使不同组分得到分离。

2.液相：

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

二、应用范围：

1.气相：

气相色谱法具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。

一般对500℃以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采用衍生化法或裂解法。

2.液相：

高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。

对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400以上）的有机物（些物质几乎占有机物总数的75%～

80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。

据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。

三、仪器构造：

1.气相：

由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成。

进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。

1.1柱箱：

色谱柱是气相色谱仪的心脏，样品中的各个组份在色谱柱中经过反复多次分配后得到分离，从而达到分析的目的，柱箱的作用就是安装色谱柱。

由于色谱柱的两端分别连接进样器和检测器，因此进

样器和检测器的下端（接头）均插入柱箱。

柱箱能够安装各种填充柱和毛细管柱，并且操作方

便。

色谱柱（样品）需要在一定的温度条件下工作，因此采用微机对柱箱进行温度控制。

并且由于设计合理，柱箱内的梯度很小。

对于一些成份复杂、沸程较宽的样品，柱箱还可进行三阶程序升温控制。

且程序设定后自动运行无需人工干预，降温时还能自动后开门排热。

1.2进样器：

进样器的作用是将样品送入色谱柱。

如果是液体样

品，进样器还必须将其汽化，因此采用微机对进样

器进行温度控制。

根据不同种类的色谱柱及不同的进样方式，共有五种

进样器可供

选择：

1.填充柱进样器

2.毛细管不分流进样器附件

3.毛细管分流进样器附件

4.毛细管分流/不分流进样器

5.六通阀气体进样器

1.3检测器:

检测器的作用是将样品的化学信号转化为物理信号

（电信号）。

检测器也需要在一定的温度条件下才能正常工作，因

此采用微机对检测器进行温度控制。

根据各种样品的化学物理特性，共有五种检测器可供

选择：

1.氢火焰离子化检测器（FID）

2.热导检测器（TCD）

3.电子捕获检测器（ECD）

4.氮磷检测器（NPD）

5.火焰光度检测器（FPD）

1.4数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

2.液相：

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系

统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成。

2.1进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操

作，进样量是恒定的。

这对提高分析样品的重复性是

有益的。

2.2输液系统该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。

高压泵的一般压强为l．47～4．4X107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱

中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。

流动相贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。

这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。

3.3分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。

色谱柱一般

长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加

一连接管），内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻

璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm

粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的

基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰

性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性

（孔径可达1000?

）和比表面积大的特点，加之其表面

经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），

或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟

甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体

的有机化合物。

因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。

例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。

基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。

这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。

根据柱效理论分析，基质粒度小，

塔板理论数N就越大。

这也进一步证明基质粒度小，

会提高分辨率的道理。

再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到

60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层

析柱的效率。

2.4检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光

检测器和荧光检测器三种。

（1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样

品的检测。

其特点：

使用面广（如蛋白质、核酸、氨

基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高

（检测下限为10-10g／ml）；线性范围宽；对温度和

流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。

（2）示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示

差折光检测器检测。

，糖类化合物的检测使用此检

测系统。

这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低

（检测下限为10-7g／ml），流动相的变化会引起折光

率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用

于梯度洗脱样品的检测。

（3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光

强度与物质的浓度成正比。

因此，这一检测器只适用

于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺

类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高

（检测下限为10-12～10-14g／ml），痕量分析和梯度

洗脱作品的检测均可采用

2.5数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和

处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确

开展。

光度定义

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。

常用的波长范围为：

（1）200～400nm的紫外光区

（2）400～760nm的可见光区,（3）2.5～25μm（按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>）的红外光区。

所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。

为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。

仪器组成

分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。

常用于核酸，蛋白

定量以及细菌生长浓度的定量。

仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。

光谱范围

包括波长范围为400~760nm的可见光区和波长范围为200～400nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.

钨灯的发射光谱:

钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱光通过三棱镜折射后,可得到由红橙,黄绿,蓝靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.

氢灯（或氘灯）的发射光谱:

氢灯能发出185～400nm波长的光谱可作为紫外光光度计的光源.

物质的吸收光谱

（1）

如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.

不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.

物质的吸收光谱

（2）

当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收只有一部分光可透过溶液.

入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光

如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失则:

入射光=吸收光十透过光

2原理

分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。

样品的吸光值与样品的浓度成正比。

单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：

A=-lg（I/I。

）=-lgT=kLc

式中:

A为吸光度；

基本原理

I。

为入射的单色光强度；

I为透射的单色光强度；

T为物质的透射率；

k为摩尔吸收系数；

L为被分析物质的光程，即比色皿的边长

c为物质的浓度

物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。

当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。

在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理

使其显色后再测定,故又称比色分析。

由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。

核酸的定量

核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。

可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。

核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。

每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。

定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。

如：

1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。

测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。

测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。

然而，实验并非一帆风顺。

读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。

灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。

如EppendorfBiophotometer的准确度≤1.0%（1A）。

这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。

另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：

在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。

样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：

由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。

这些小颗粒的存在干扰测试效果。

为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。

在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。

从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。

最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。

纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。

如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。

A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。

纯样品，A320一般是0。

蛋白质的直接定量（UV法）

这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。

选择Warburg公式，光度计可以直接显示

出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。

蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。

由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm的“背景”信息，设定此功能“开”。

与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的线性范围在1.0-1.5之间。

实验中选择Warburg公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。

这是一个正常的现象。

事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%，表明结果非常稳定。

漂移的原因是因为Warburg公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。

蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。

紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。

比色法蛋白质定量

蛋白质通常是多种蛋白质的混合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：

氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。

有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。

比色方法

一般有BCA，Bradford，Lowry等几种方法。

Lowry法：

以最早期的Biuret反应为基础，并有所改进。

蛋白质与Cu2反应，产生蓝色的反应物。

但是与Biuret相比，Lowry法敏感性更高。

缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Tritonx-100，ammoniasulfate等物质的蛋白不适合此种方法。

BCA（Bicinchoninineacidassay）法：

这是一种较新的、更敏感的蛋白

测试法。

要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2反应产生Cu，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。

此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。

相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。

但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

Bradford法：

这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。

其最大的特点是，敏感度好，是Lowry和BCA两种测试方法的2倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。

但是对于去污剂依然是敏感的。

最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。

某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？

由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。

例如：

Keller等测试人奶中的蛋白，结果Lowry，BCA测出的浓度明显高于Bradford，差异显著。

即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。

如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质，以BSA作标准品，浓度1.34mg/ml，以a球蛋白作标准品，浓度2.64mg/ml。

因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。

另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。

关键问题是，反应后1011分光光度计的重要配件——比色杯的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。

时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。

除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。

此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。

避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。