出口水果中乙硫磷残留量检验方法编制说明.docx
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出口水果中乙硫磷残留量检验方法编制说明
《进出口植物源食品中乙硫磷残留量的测定》
修订说明
一、任务来源
本标准的制定任务是根据国家认证认可监督管理委员会于2012年下达《出口植物源食品中乙硫磷残留量的测定》行业标准任务，计划编号为2012B305r的，修订原行业标准SN0151-92《出口水果中乙硫磷残留量检验方法》，由安徽出入境检验检疫局修订完成。
二、修订依据
1修订的目的及意义
农业是我国国民经济的基础，是人们的衣食之源、生存之本，农业、农村和农民问题始终是一个关系到我国经济发展、社会稳定的全局性、根本性问题。
农产品出口对增加农民收入和优化农业产业结构作用显著，据统计，2011年我国农产品出口总额达到607.5亿美元。
但是，随着我国农产品贸易的快速发展，农产品出口面临越来越多的障碍，检验检疫、技术标准等方面的技术性贸易壁垒在农产品国际贸易中日渐增多，所涉及的农产品范围日趋扩大，从而对我国农产品的出口造成很大影响。
乙硫磷又称1240、蚜螨立死或益寒昂，是一种高效、高毒、广谱性有机磷杀虫剂。
其工业品为黄褐色油状液体，有酸臭味，在常温下挥发很小，不溶于水，易溶于多种有机溶剂，在碱性溶液中很容易分解失效，主要剂型为乳油。
乙硫磷具有良好的触杀和胃毒作用。
可以防治多种作物的螨类害虫，特别是对棉花红蜘蛛、柑桔红蜘蛛、锈壁虱和棉叶蝉、水稻飞虱、蓟马效果更加显著，并能杀死螨卵，是一种高效杀螨剂[1]。
图1乙硫磷化学结构式
乙硫磷容易在植物源性食品，尤其是水果蔬菜中发生残留，且残留量高，残留时间长，并可通过食物链传递并富集，进入人体，对人体健康将造成严重危害。
乙硫磷等有机磷类农药属于神经毒物，主要抑制血液和组织中乙酰胆碱酯酶的活性，可导致神经递质，乙酰胆碱的大量蓄积，从而阻断神经传导，引起中枢神经系统中毒。
乙硫磷工业品对人畜毒性较强，大鼠口服LD5096mg/kg，大量使用乙硫磷类农药，将对人、动物和环境会产生严重危害。
为此，世界各国针对不同植物源类食品纷纷制定了乙硫磷残留限量标准，欧盟更是将乙硫磷列为禁用农药范围。
目前，我国在GB2763-2005中规定稻谷中乙硫磷最大残留限量为0.2mg/kg，棉籽油中乙硫磷最大残留限量为0.5mg/kg。
而韩国、英国、欧盟等一些国家和地区对部分植物源食品中乙硫磷最大残留限量要求却已达到0.01mg/kg[2]（各国部分植物源食品中乙硫磷的最大残留限量要求见表1）。
这就对我们的检测方法和技术提出了新的挑战，如何能够快速、灵敏、准确的测定植物源类食品中残留乙硫磷将对于我国相关农产品的进出口及食品安全起到很大意义。
表1各国部分植物源食品中乙硫磷的最大残留限量（mg/kg）
化合物
产品
中国
中国香港
美国
澳大利亚
泰国
新加坡
印度
日本
欧盟
韩国
英国
乙硫磷
大米
0.2
0.2
0.025
0.01
0.01
0.01
玉米
0.05
0.025
0.01
0.01
0.01
大豆
1
1
1
0.02
0.01
0.02
桃
1
1
1
0.3
0.01
0.01
0.01
葡萄
2
2
0.3
0.01
0.01
0.01
柑橘类水果
5
1
1
2
2
5
0.01
0.01
0.01
梨
1
2
2
0.3
0.01
0.01
0.01
草莓
5
2
2
0.3
0.01
0.01
0.01
西兰花
1
0.3
0.01
0.01
0.01
苹果
1
2
2
0.3
0.01
0.01
0.01
番茄
0.3
2
1
0.3
0.01
0.01
0.01
茄子
0.3
1
1
0.3
0.01
0.01
0.01
黄瓜
0.5
0.5
0.3
0.01
0.01
0.01
茶
5
5
5
0.3
3
3
原标准SN0151-92《出口水果中乙硫磷残留量检验方法》于1992年制定完成，此标准在实施期间被检验检疫系统、进出口企业和其他相关部门广泛采用，为我国进出口水果检验把关、突破国外技术壁垒、保障我国食品安全提供了技术手段和依据，取得了良好的经济效益和社会效益。
但此标准的实施已有20年，随着国内外相关检测技术和设备的发展，以及国内外对植物源食品中乙硫磷残留限量的要求的提高，有必要对现行的标准按照GB/T1.1最新版本的要求进行相应的修订，应用现代样品前处理手段，提高样品的提取净化效率，提高检测灵敏度、降低检测低限，同时增加样品基质和对阳性样品的确证技术，从而满足当前国际贸易和食品安全管理要求，为我国进出口食品提供可靠的检测服务。
2方法综述
目前文献报道中的有关乙硫磷残留量的分析方法报道有线性扫描溶出伏安法[3]、GC-FPD法[4]、GC-MS法[5]、GC-MS/MS法[6]以及LC-MS/MS方法[7]。
目前，GC-FPD方法和GC-MS方法是实际检测中应用最为广泛的两种检测方法，其他的方法由于自身的一些缺点而没有得到广泛使用。
本次修订的标准SN0151－1992《出口水果中乙硫磷残留量检验方法》标准采用丙酮提取，用石油醚反萃并经无水硫酸钠柱脱水后浓缩，用GC-FPD检测。
随着国际贸易和食品安全管理的需要，有必要对该标准进行修订，建立确证的气相色谱-质谱联用检测法。
本标准检测范围涉及大米、番茄、西兰花、大豆油、桃、梨、草莓、苹果、茶叶5种主要植物源样品。
按照GB/T1.1-2000《标准化工作导则》第一单元：
标准的起草与表述规则第一部分：
标准的结构和编写的规则、GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：
化学分析方法》及SN/T0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》（以下简称《规定》）的要求进行编写，本方法正在经河南出入境检验检疫局、江西出入境检验检疫局、江苏出入境检验检疫局、安徽省疾病预防控制中心、安徽省化工产品质量监督检验站等5家单位进行验证试验。
3标准制定的主要过程
2012年7月，负责人进行资料查阅、汇总，调查研究，实验方案初步设计，成立起草小组，完成实验前期准备工作。
2012年8月—12月，完成GC、GC/MS法测定条件摸索及优化。
2013年1月—3月，研究样品前处理方法，初步建立乙硫磷残留量检测方法。
2013年4月—7月，对不同基质样品，进行方法验证实验，整理数据。
2013年8-9月，进行实验室间协同试验和验证工作，完成标准的征求意见稿。
2013年10-12月，完成意见汇总的工作，修改征求意见稿，完成送审稿。
4方法技术论证
本标准依据国际上对食品中乙硫磷最高残留限量（MRL）要求，研究建立了大米、番茄、西兰花、大豆油、桃、梨、草莓、苹果、茶叶等植物源食品中乙硫磷残留量的GC-FPD检测方法和GC-MS阳性确证方法。
本标准经方法提取效率试验、净化方法选择试验、测定和确证条件试验、回收率试验、精密度试验、方法协同验证试验。
实验结果表明：
本法科学合理、技术先进，测定准确度和精密度高，阳性判别结果准确可靠，检测限和应用范围能够满足目前国内外检测限量的要求。
方法的灵敏度、准确度、精密度、专属性及确证的可靠性等方面符合国际通用的质量控制要求。
4.1乙硫磷标准溶液的稳定性
乙硫磷纯品为无色或琥珀色液体，熔点-12~-15℃，沸点125℃（13Pa），25℃时蒸气压为2×10-4Pa，相对密度（d425）为1.22。
微溶于水，可溶于丙酮、甲醇、乙醇等大多数有机溶剂，酸碱液中水解，空气中缓慢氧化。
准确称取适量乙硫磷标准品（精确至0.1mg），用少量丙酮溶解，然后用乙酸乙酯配制成浓度为100mg/L标准储备溶液，贮于冰箱（4℃）。
表1乙硫磷标准溶液稳定性试验结果
储存时间
储存条件
-20℃
+4℃
+20℃
一周
99.5
98.0
98.9
一个月
101.6
98.5
100.8
三个月
98.3
97.8
99.6
六个月
98.1
98.4
98.7
4.2前处理条件的选择
原标准使用丙酮作为提取溶剂，根据乙硫磷的性质，我们选择用丙酮、乙酸乙酯和乙腈作为提取溶剂，比较它们的提取效果。
试验结果表明，乙腈有更满意的提取效果，因此本方法将提取溶剂由丙酮改为乙腈。
考察了高速均质提取、涡旋提取、振荡提取和超声提取四种提取方法，高速均质提取的提取效率最高，提取时间2min，回收率可以达到80%；涡旋提取次之，超声提取提取效率最低。
因此本标准选择高速均质提取来提取植物源食品中的乙硫磷残留
原标准净化时使用石油醚反萃。
考虑到试验技术的发展、方法的重现性、干扰因素的降低，我们改为使用商品化的固相萃取小柱进行净化。
净化条件的选择主要考察了固相萃取小柱的选用，试验中我们选择了不同的固相萃取小柱以考察净化效果。
试验中选择了中性氧化铝柱、氟罗里硅土柱、PSA柱、石墨化碳黑柱、氨基柱、ENVI-Carb/PSA柱、ENVI-Carb/NH2进行了净化效果的对比。
通过回收率结果和净化效果的综合比较，我们认为ENVI-Carb/PSA柱的净化效果最佳，既达到了满意的净化效果也保证了满意的回收率。
实验中选择乙腈-甲苯（3:
1）作为洗脱溶剂，并考察了乙硫磷在ENVI-Carb/PSA柱上的洗脱曲线（如图1），实验结果表明，10mL乙腈-甲苯基本能够洗脱完全。
图1ENVI-Carb/PSA柱的淋洗曲线
4.3色谱条件的选择及优化
本研究选用了农药残留分析常用的DB-1701（30m×0.53mm×1μm）石英毛细管色谱柱，经过反复实验，效果比较理想，乙硫磷特征峰与杂质峰能有效分离，能满足实验要求。
故本方法选用了DB-1701毛细管色谱柱作为色谱分离柱。
在实验所选条件下，目标化合物乙硫磷的出峰时间约为11.3min（如图2），与不同基质中的干扰峰分离良好。
各种基质样品及样品不同添加水平的气相色谱图如图3~图11所示。
样品定容至1mL。
图2-1乙硫磷标准溶液气相色谱图（0.1μg/ml）
图2-2乙硫磷标准溶液气相色谱图（0.5μg/ml）
图2-3乙硫磷标准溶液气相色谱图（1.0μg/ml）
图2-4乙硫磷标准溶液气相色谱图（2.0μg/ml）
图2-5乙硫磷标准溶液气相色谱图（5.0μg/ml）
图3-1空白桃子样品气相色谱图
图3-2桃子样品添加乙硫磷的气相色谱图（0.01mg/kg）
图3-3桃子样品添加乙硫磷的气相色谱图（1.0mg/kg）
图3-4桃子样品添加乙硫磷的气相色谱图（5.0mg/kg）
图4-1空白大米样品气相色谱图
图4-2大米样品添加乙硫磷的气相色谱图（0.01mg/kg）
图4-3大米样品添加乙硫磷的气相色谱图（1.0mg/kg）
图4-4大米样品添加乙硫磷的气相色谱图（5.0mg/kg）
图5-1空白番茄样品气相色谱图
图5-2番茄样品添加乙硫磷的气相色谱图（0.01mg/kg）
图5-3番茄样品添加乙硫磷的气相色谱图（1.0mg/kg）
图5-4番茄样品添加乙硫磷的气相色谱图（5.0mg/kg）
图6-1空白西兰花样品气相色谱图
图6-2西兰花样品添加乙硫磷的气相色谱图（0.01mg/kg）
图6-3西兰花样品添加乙硫磷的气相色谱图（1.0mg/kg）
图6-4西兰花样品添加乙硫磷的气相色谱图（5.0mg/kg）
图7-1空白大豆油样品气相色谱图
图7-2大豆油样品添加乙硫磷的气相色谱图（0.01mg/kg）
图7-3大豆油样品添加乙硫磷的气相色谱图（1.0mg/kg）
图7-4大豆油样品添加乙硫磷的气相色谱图（5.0mg/kg）
图8-1空白茶叶样品气相色谱图
图8-2茶叶样品添加乙硫磷的气相色谱图（0.01mg/kg）
图8-3茶叶样品添加乙硫磷的气相色谱图（1.0mg/kg）
图8-4茶叶样品添加乙硫磷的气相色谱图（5.0mg/kg）
图9-1空白梨样品气相色谱图
图9-2梨样品添加乙硫磷的气相色谱图（0.01mg/kg）
图9-3梨样品添加乙硫磷的气相色谱图（1.0mg/kg）
图9-4梨样品添加乙硫磷的气相色谱图（5.0mg/kg）
图10-1空白草莓样品气相色谱图
图10-2草莓样品添加乙硫磷的气相色谱图（0.01mg/kg）
图10-3草莓样品添加乙硫磷的气相色谱图（1.0mg/kg）
图10-4草莓样品添加乙硫磷的气相色谱图（5.0mg/kg）
图11-1空白苹果样品气相色谱图
图11-2苹果样品添加乙硫磷的气相色谱图（0.01mg/kg）
图11-3苹果样品添加乙硫磷的气相色谱图（1.0mg/kg）
图11-4苹果样品添加乙硫磷的气相色谱图（5.0mg/kg）
4.3.2气相色谱－质谱条件
本试验选用HP-5MS（30m×0.25mm×0.25μm），采用梯度升温方式，目标化合物在25.5min左右出峰，可获得良好的分离，在所验证的样品中乙硫磷均能与干扰组分有效分离，所以质谱检测时选用HP-5MS色谱柱。
质谱检测采用选择离子监测的模式,在选择监测离子时选用丰度较高且分子量较大碎片并结合参考了相关标准和文献[8-12]，选择m/z231:
153:
125:
384为监测离子，m/z231相应强，干扰峰少，选择m/z231为定量离子。
本方法对阳性样品采用保留时间与特征选择离子丰度比双重定性。
在标准给定的气相色谱-质谱条件下，乙硫磷的保留时间约为25.5min（见图12）。
乙硫磷选择监视离子（m/z）丰度比是231:
153:
125:
384=100:
65:
52:
13。
将样品溶液均按规定的气相色谱-质谱条件进行测定，样品溶液中出现与乙硫磷有相同保留时间的峰时，则对其进行质谱确证，若该峰的选择监测离子的数目及丰度比满足乙硫磷的监测离子，我们可判为阳性样品。
试验表明，本方法所选的监测离子灵敏度高，抗干扰性强，定量准确。
在本方法选定的气相色谱-质谱条件下，乙硫磷样品空白及样品不同添加水平的SIM色谱图见图13～20。
图12-1乙硫磷标准溶液质谱图（0.1μg/ml）
图12-2乙硫磷标准溶液质谱图（0.5μg/ml）
图12-3乙硫磷标准溶液质谱图（1.0μg/ml）
图12-4乙硫磷标准溶液质谱图（2.0μg/ml）
图12-5乙硫磷标准溶液质谱图（5.0μg/ml）
图13-1空白桃子样品GC-MS选择离子色谱图
图13-2桃子样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（0.01mg/kg）
图13-3桃子样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（1.0mg/kg）
图13-4桃子样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（5.0mg/kg）
图14-1空白大米样品GC-MS选择离子色谱图
图14-2大米样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（0.01mg/kg）
图13-3大米样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（1.0mg/kg）
图13-4大米样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（5.0mg/kg）
图14-1空白番茄样品GC-MS选择离子色谱图
图14-2番茄样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（0.01mg/kg）
图14-3番茄样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（1.0mg/kg）
图14-4番茄样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（5.0mg/kg）
图15-1空白西兰花样品GC-MS选择离子色谱图
图15-2西兰花样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（0.01mg/kg）
图15-3西兰花样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（1.0mg/kg）
图15-4西兰花样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（5.0mg/kg）
图16-1空白大豆油样品GC-MS选择离子色谱图
图16-2大豆油样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（0.01mg/kg）
图16-3大豆油样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（1.0mg/kg）
图16-4大豆油样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（5.0mg/kg）
图17-1空白茶叶样品GC-MS选择离子色谱图
图17-2茶叶样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（0.01mg/kg）
图17-3茶叶样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（1.0mg/kg）
图17-4茶叶样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（5.0mg/kg）
图18-1空白梨样品GC-MS选择离子色谱图
图18-2梨样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（0.01mg/kg）
图18-3梨样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（1.0mg/kg）
图18-4梨样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（5.0mg/kg）
图19-1空白草莓样品GC-MS选择离子色谱图
图19-2草莓样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（0.01mg/kg）
图19-3草莓样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（1.0mg/kg）
图19-4草莓样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（5.0mg/kg）
图20-1空白苹果样品GC-MS选择离子色谱图
图20-2苹果样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（0.01mg/kg）
图20-3苹果样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（1.0mg/kg）
图20-4苹果样品添加乙硫磷的GC-MS选择离子色谱图（5.0mg/kg）
4.4线性与测定低限
气相色谱法：
取0.1μg/ml~5.0μg/ml的系列标准溶液，进样检测，以峰面积（Y）对乙硫磷浓度（X）作线性回归分析，其回归方程是Y=32692.33X+469.80，相关系数r=0.9998。
图21乙硫磷标准曲线图（气相色谱法）
气相色谱-质谱联用法：
取0.1μg/ml~5.0μg/ml的系列标准溶液，进样检测，以峰面积（Y）对乙硫磷浓度（X）作线性回归分析，其回归方程是Y=9.541×105X-1.230×105，相关系数r=0.9988。
图22乙硫磷标准曲线图（气相色谱-质谱联用法）
通过标准添加实验确定本方法的测定低限为0.01mg/kg，达到当前最低的残留限量要求。
本方法测定低限符合SN/T0001-1995《规定》和残留分析质量控制指南对测定低限的要求。
4.5回收率及精密度
本方法采用添加回收的方法，对本底不含马拉硫磷的大米、小麦、高粱、玉米分别添加0.01、1、5mg/kg3个水平的样品进行回收测定，每个水平重复6次，回收率和室内精密度结果见表2和表3。
表2乙硫磷残留量测定的实验室内回收率和精密度（GC，n=6）
样品名称
大米
添加水平
0.01mg/kg
1mg/kg
5mg/kg
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
1
0.0070
70
0.97
97
4.71
94
2
0.0068
68
0.91
91
4.58
92
3
0.0090
90
1.03
103
4.64
93
4
0.0085
85
0.80
80
4.85
97
5
0.0080
80
0.85
85
4.43
87
6
0.0077
77
0.85
85
4.95
99
平均值
78
90
94
CV（%）
10.9
9.5
4.0
样品名称
大豆油
添加水平
0.01mg/kg
1mg/kg
5mg/kg
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
1
0.0079
79
0.93
93
4.41
88
2
0.0093
93
0.99
99
4.73
95
3
0.0080
80
1.03
103
4.36
87
4
0.0075
75
0.82
82
4.28
86
5
0.0065
65
0.96
96
4.62
92
6
0.0087
87
0.96
96
4.11
82
平均值
80
95
88
CV（%）
12.1
7.5
5.1
样品名称
番茄
添加水平
0.01mg/kg
1mg/kg
5mg/kg
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
1
0.0079
79
0.81
81
4.34
87
2
0.0091
91
1.00
100
4.52
90
3
0.0073
73
0.88
88
4.86
97
4
0.0074
74
0.84
84
4.74
95
5
0.0084
84
0.89
89
5.02
100
6
0.0068
68
0.91
91
4.70
94
平均值
78
89
94
CV（%）
10.7
7.4
5.1
样品名称
草莓
添加水平
0.01mg/kg
1mg/kg
5mg/kg
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
1
0.0045
90
1.04
104
4.50
90
2
0.0038
76
0.95
95
4.95
99
3
0.0046
92
0.91
91
4.41
88
4
0.0049
98
0.94
73
4.62
92
5
0.0048
96
0.89
89
4.65
93
6
0.0033
66
0.97
77
4.32
86
平均值
86
95
92
CV（%）
13.7
5.5
4.8
样品名称
苹果
添加水平
0.01mg/kg
1mg/kg
5mg/kg
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
测定值
（mg/kg）
回收率
（％）
1
0.0073
73
0.90
90
4.34
87
2
0.0094
94
0.88
88
4.89
98
3
0.0071
71
0.98
98
4.79
96
4
0.0076
76
1.01
101
4.22
84
5
0.0094
94
0.81
81
4.72
94
6
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