微生物限度检查法实验准备DOC.docx
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微生物限度检查法
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃。
检验结果以1g、lml、10g、l0ml或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量
检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试验）。
检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。
供试液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
2.固体、半固体或黏稠性供试品
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至1OOml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1:
10的供试液。
必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
（6）具抑菌活性的供试品
当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性，再依法检查。
常用的方法如下。
②离心沉淀法 取一定量的供试液，500转／分钟离心3分钟，取全部上清液混合。
用于细菌检查。
细菌、霉菌及酵母菌计数
计数培养基的适用性检查
细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
菌种
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌（Escherichiacoli[CMCC（B）44l02]
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]
枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis ）[CMCC（B）63501]
白色念珠菌（Candidaalbicans）〔CMCC（F）98001〕
黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]
菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48小时。
上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为50～100CFU的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5～7天，加人3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50～100CFU的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
适用性检查
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌各50～100CFU，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；
取白色念珠菌、黑曲霉各50～100CFU，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数；
取白色念珠菌50～100CFU，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基．平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
结果判定
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
计数方法的验证
当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。
若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。
对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
（细菌，酵母菌和霉菌分别都需要计数方法的验证）
菌种及菌液制备
同计数培养鉴的适用性检查。
验证方法
验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
（l）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液lml和50～100CFU试验菌，分别注人平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加人50～100CFU试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。
（2）菌液组 测定所加的试验菌数。
（3）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
（4）稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。
试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每lml供试液含50～100CFU，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
结果判断
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。
若试验组的菌数回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70％，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法（常见干扰物的中和剂或灭活方法见表1）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。
验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
供试品检查
计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。
检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。
按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。
用稀释液稀释成1:
10、1:
l02、l:
103等稀释级的供试液。
1．平皿法
根据菌数报告规则取相应稀释级的供试液lml，置直径90mm的无菌平皿中，注人15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
阴性对照试验
取试验用的稀释液lml，置无菌平皿中．注入培养基，凝固，倒置培养。
每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。
培养和计数
除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。
菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。
点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15．则两个平板的菌落数不能相差l倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。
在特殊情况下．若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。
然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。
含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。
菌数报告规则
细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300CFU、霉菌宜选取平均菌落数小于100CFU的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。
以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、lml或10cm2供试品中所含的菌数。
如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
控制菌检查
控制菌检查用培养基的适用性检查
控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
菌种
对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。
大肠埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44l02]
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]
菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～24小时，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为10～100CFU的菌悬液。
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用．若保存在2～8℃可在24小时内使用。
适用性检查
控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。
各培养基的检测项目及所用菌株见表2。
表2控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示能力检查
控制菌检查
培养基
特性
试验菌株
大肠埃希菌
胆盐乳糖培养基
促生长能力
大肠埃希菌
抑制能力
金黄色葡萄球菌
4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基
促生长能力+指示能力
大肠埃希菌
曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基
促生长能力+指示能力
大肠埃希菌
液体培养基促生长能力检查
分别接种不大于100CFU的试验菌（表2）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。
与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。
固体培养墓促生长能力检查
取试验菌各0.1ml（含菌数50～100CFU）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。
被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。
培养基抑制能力检查
接种不少于100CFU的试验菌（表2）于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。
固体培养基指示能力检查
取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100CFU）（表2）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。
被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
液体培养基指示能力检查
分别接种不大于100CFU的试验菌（表2）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。
与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。
控制菌检查方法的验证
当建立产品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。
验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，
菌种及菌液制备
同控制菌检查用培养基的适用性检查。
验证方法
取规定量供试液及10～100CFU试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。
结果判断
若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。
供试品检查
供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。
阳性对照试验
阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌的加菌量为10～10OCFU。
阳性对照试验应检出相应的控制菌。
阴性对照试验
取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。
阴性对照应无菌生长
大肠杆菌检查方法
（1）大肠埃希菌（Escherichiacoli） 取供试液10ml（相当于供试品lg、lml、10cm2），直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。
取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。
若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。
观察后，沿培养管的管壁加人数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。
本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。
结果验证
如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。
若平板上无菌落生长或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。
若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验，确认是否为大肠埃希菌。
表3大肠埃希菌菌落形态特征
培养基
菌落形态
曙红亚甲蓝琼脂
紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽
麦康凯琼脂
鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润
菌种
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌（Escherichiacoli[CMCC（B）44l02]
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]
枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis ）[CMCC（B）63501]
白色念珠菌（Candidaalbicans）〔CMCC（F）98001〕
黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]
稀释液
稀释液配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
1.pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
照无菌检查法（附录XIIA）制备。
2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液
按缓冲液（二部附录XVD）配制后，过滤，分装，灭菌。
如需要，可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
3.0.9％无菌氯化钠溶液
取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装，灭菌。
4.靛基质试液
培养基及其制备方法
培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。
配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
照无菌检查法（附录XIIA）制备
1.营养琼脂培养基、对照
2.营养肉汤培养基、
3.硫乙醇酸盐流体培养基、
4改良马丁培养基
5.改良马丁琼脂培养基
2.玫瑰红钠琼脂培养基对照
胨 5.0g
玫瑰红钠 0.0133g
葡萄糖 10.0g
琼脂 14.0g
磷酸二氢钾 1.0g
水 1000ml
硫酸镁 0.5g
除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄糖、玫瑰红钠，分装．灭菌。
3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）对照
胨 10.0g
琼脂 14.0g
酵母浸出粉 5.0g
水 1000ml
葡萄糖 20.0g
除葡萄糖外，取上述成分．混合，微温溶解，滤过，加人葡萄糖，分装．灭菌。
4．胆盐乳糖培养基（BL）对照
胨 20.0g
磷酸二氢钾 1.3g
乳糖 5.0g
牛胆盐 2.0g
氯化钠 5.0g
（或去氧胆酸钠） （0.5g）
磷酸氢二钾 4.0g
水 1000ml
除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.4±0.2，煮沸，滤清，加人乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。
5.乳糖胆盐发酵培养基对照
胨 20.0g
0.04％溴甲酚紫指示液 25ml
乳糖 10.0g
水 l000ml
牛胆盐 5.0g
除0.04％溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.4±0.2，加人0.04％溴甲酚紫指示液，根据要求的用量分装于含倒管的试管中。
灭菌。
所用倒管的规格应保证产气结果的观察。
6．曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）对照
营养琼脂培养基 100ml
曙红钠指示液 2ml
20％乳糖溶液 5ml
亚甲蓝指示液 1.3～1.6ml
取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液，摇匀，倾注平皿。
7.麦康凯琼脂培养基（MacC）对照
胨 20.0g
1％中性红指示液 3ml
乳糖 10.0g
琼脂 14.0g
牛胆盐 5.0g
水 l000ml
氯化钠 5.0g
除乳糖、1％中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。
8.4-甲基伞形酮葡糖昔酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuionide，MUG）培养基对照
胨 10.0g
磷酸二氢钾（无水） 0.9g
硫酸锰 0.5mg
磷酸氢二钠（无水） 6.2g
硫酸锌 0.5mg
亚硫酸钠 40mg
硫酸镁 0.1g
去氧胆酸钠 1.0g
氯化钠 5.0g
MUG 75mg
氯化钙 50mg
水 l000ml
除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加人MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。
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