PPARγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因PTEN表达的影响.docx

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PPARγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因PTEN表达的影响

PPARγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因PTEN表达的影响

【摘要】目的:

观察PPARγ对人胰腺癌细胞中抑癌基因PTEN表达的影响。

方法:

体外培养人胰腺癌细胞株PANC1,使用罗格列酮和GW9662细胞分别处理PANC1细胞,RTPCR检测PANC1细胞中PTEN基因表达的变化;SABC法检测PTEN蛋白表达的变化,FCM法检测PTEN蛋白表达的百分率的变化。

结果:

PPARγ激动剂罗格列酮能够诱导抑癌基因PTEN的高表达,同时抑制剂GW9662能够抑制抑癌基因PTEN的表达,并呈一定的量效关系。

结论:

胰腺癌细胞中PPARγ的表达与抑癌基因PTEN的表达呈一定的平行关系,PPARγ可能通过一定信号转导通路调节抑癌基因PTEN的表达,从而发挥抗肿瘤的作用。

【关键词】PPARγ胰腺癌罗格列酮基因治疗

　　近年胰腺癌发病率在国内外呈上升趋势,起病隐蔽,发展迅速,又缺乏有效的早期诊断和系统治疗方法,胰腺癌早期诊断以及治疗水平均较低,促使人们不断寻求其新型有效的治疗分子靶点[1]。

目前,胰腺癌基因治疗还处于探索阶段,抑癌基因将在胰腺癌基因治疗中发挥重要作用。

研究发现人类胰腺癌表达PPARγ,PPARγ配体可以抑制巨噬细胞的活化以及浸润,是肿瘤新生血管形成重要的调节因子[2],激活PPARγ能够产生抗胰腺癌生长的效应。

PTEN基因,是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,参与细胞周期调控,同时调节细胞正常生长和发育[3]。

有研究表明50%的胰腺癌有染色体10q的缺失[1],而10q正是PTEN基因位点所在。

近年来随着对肿瘤发病机制的不断深入研究,发现PPAR

γ、PTEN与胰腺癌发生、发展有着密切的联系。

本研究中通过体外培养人胰腺癌细胞株,给予PPARγ激动剂罗格列酮,利用RTPCR、免疫细胞化学、流式细胞术（FCM）检测等方法,观察胰腺癌细胞株中抑癌基因PTEN表达的影响,为进一步探讨PPARγ抑制胰腺癌的机制提供一定的理论支持,为胰腺癌基因治疗提供新思路。

　　1材料和方法

　　1.1材料人胰腺癌细胞株PANC1（humanpancreaticcancercells,PANC1）,购自意大利ISTBanca公司。

RNA提取试剂（TRIzolReagent）、TaqDNA聚合酶、反转录酶SuperscriptⅢ、DL2000marke、DMEM培养基均为Gibco公司产品。

胎牛血清为杭州四季青公司产品。

引物由大连宝生公司合成。

格列酮为葛兰素史克公司产品。

GW9662为Sigma公司产品。

PTENantibody、二抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记为武汉博士德公司产品。

　　1.2方法

　　1.2.1引物设计通过人PTEN信号肽和编码区基因序列设计引物,在GenBank中获得所需PTEN的基因序列,由大连宝生生物技术有限责任公司合成。

人PTEN的基因序列:

senseprimer5′CCAGACATGACAGCCATC3′;antisenseprimer5′GAACTTGTCTTCCCGTCG3′。

人βactin的基因序列:

Senseprimer5′GAGGATCTTCATGAGGTAGTCTGTCAGGTC3′;antisenseprimer5′CAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCA3′。

　　1.2.2细胞培养PANC1细胞从液氮中取出后,迅速置于37℃水浴解冻复苏,加入37℃预热无血清DMEM培养液,800r/min离心5min,弃上清;细胞沉淀加入DMEM完全培养液（内含150mL/L胎牛血清、35.76g/LHEPES、青、链霉素各100U/mL）重悬,置于75cm2塑料瓶,在含50mL/LCO2的37℃孵箱里贴壁生长至融合,隔日换液,当细胞生长至80%～90%融合时,用1.25g/L胰蛋白酶消化传代。

选择生长良好的PANC1细胞,接种于6孔细胞培养板,接种密度为1×104/孔。

　　1.2.3细胞总RNA的提取使用罗格列酮和GW9662细胞分别处理PANC1细胞,使用PBS溶液（含1μmol/LDMSO,pH7.4）处理空白对照组细胞。

罗格列酮组,细胞培养体系中分别加入1μmol/L、10μmol/L罗格列酮溶液（1μmol/LDMSO）,50mL/LCO2、37℃孵育2、6、12、24、48h;GW9662组,细胞培养体系中加入10μmol/LGW9662溶液（1

μmol/LDMSO）,50mL/LCO2、37℃孵育48h。

　　1.2.4RTPCR反应体系50μL按以下反应条件进行RTPCR反应:

混匀,离心10s;94℃预变性5min;变性94℃50s;退火60℃45s;延伸72℃90s;共25个循环;末次循环后,72℃再延伸10min;样品冷却后4℃保存。

　　1.2.5琼脂糖凝胶电泳取PCR产物5μL,加1μL的loadingbuffer混匀,加入样品孔内;接通电源,DNA样品由负极向正极泳动,电压为5V/cm,30min后终止电泳;5mg/L溴化乙锭（EB）染色,凝胶成像仪观察图像。

　　1.2.6细胞爬片的制备选择对数生长期PANC1细胞,用1.25g/L胰蛋白酶液消化制成单细胞悬液,调节细胞密度,将细胞接种于预先准备好玻片的培养皿中（0.1g/L多聚赖氨酸处理载玻片）;细胞分为罗格列酮和GW9662处理组,空白对照组的细胞用PBS溶液（含1μmol/LDMSO,pH7.4）处理。

罗格列酮组,细胞培养体系分别加入1μmol/L和10μmol/L罗格列酮溶液（1μmol/LDMSO）,50mL/LCO2,37℃孵育48h;GW9662组,细胞培养体系加入10μmol/L的GW9662溶液（1μmol/LDMSO）,50mL/LCO2,37℃孵育48h。

待细胞再次进入对数生长期,取出玻片,PBS洗涤,4℃丙酮固定10min,PBS洗2遍,37℃烘干,-20℃冻存备用。

　　1.2.7免疫组织化学染色免疫组织化学染色采用SABC法,具体步骤参考说明书进行。

阴性对照用PBS代替一抗。

荧光显微镜观察结果,细胞中出现棕黄色颗粒判为阳性。

　　1.2.8FCM检测PTEN蛋白的表达选择生长良好的PANC1细胞,分为罗格列酮和GW9662处理组,空白对照组的细胞用PBS溶液（含1μmol/LDMSO,pH7.4）处理。

罗格列酮组,细胞培养体系加10μmol/L的罗格列酮溶液（1μmol/LDMSO）,50mL/LCO2,37℃孵育48h;GW9662组细胞,加入10μmol/L的GW9662溶液（1μmol/LDMSO）,50mL/LCO2,37℃孵育48h。

1.25g/L胰酶消化PANC1细胞,制备悬液,调整细胞密度为1×109/L;1mL的PANC1细胞悬液中,分别加入PTEN抗体和IgG对照抗体（1μL,1∶200）,标记荧光,37℃水浴1h,PBS缓冲液离心冲洗;再加入20g/L多聚甲醛40μL固定。

FCM测定PANC1细胞中PTEN蛋白表达的百分率。

　　1.2.9统计学处理全部数据均以x±s表示,应用SPSS10.0统计软件进行t检验,分析各组结果差异。

　　2结果

　　2.1PPARγ调节胰腺癌PANC1细胞中PTEN基因表达罗格列酮与人胰腺癌PANC

1细胞孵育2～48h后,结果表明人胰腺癌PANC1细胞中PTEN基因的表达明显增高,并呈一定的剂量依赖性;而PPARγ的抑制剂GW9662与人胰腺癌PANC1细胞孵育后,能够明显抑制PTEN基因的表达。

凝胶上出现约为1063bp的条带为所需片段,即为PTEN基因片段（图1、2）。

　　图1罗格列酮对PTEN基因表达的影响（略）

　　Fig1ExpressionofPTENinpancreaticcancercellsPANC1iseffectedbyrosiglitazone

　　A:

Rosiglitazone1μmol/L;B:

Rosiglitazone10μmol/L.M:

DNAmarker;1:

Normal;2:

2h;3:

6h;4:

12h;5:

24h;6:

48h.

　　图2抑制剂GW9662对PTEN基因表达的影响（略）

　　Fig2ExpressionofPTENinpancreaticcancercellsPANC1iseffectedbyInhibitorGW9662

　　M:

DNAmarker;1:

Normal;2:

Rosiglitazone1μmol/L;3:

Rosiglitazone10μmol/L;4:

GW966210μmol/L.　　2.2PPARγ

调节胰腺癌PANC1细胞中PTEN蛋白表达与正常对照组相比,经过10μmol/L罗格列酮处理48h的细胞,细胞质中棕黄色颗粒明显增加,细胞核被苏木素染成蓝紫色;而经过10μmol/LGW9662处理的细胞,细胞质中无明显的棕黄色颗粒,细胞核被苏木素染成蓝紫色;提示过氧化物酶增殖物活化受体γ（PPARγ）的激动剂罗格列酮能够诱导PTEN蛋白的表达,而抑制剂GW9662能够抑制PTEN蛋白的表达（图3）。

　　图3PPARγ调节胰腺癌PANC1细胞中PTEN蛋白表达（略）

　　Fig3ExpressionofPTENinpancreaticcancercellsPANC1regulatedbyPPARγ（×400）

　　A:

Normalgroup;B:

Rosiglitazonegroup;C:

GW9662group.

　　2.3FCM观察PPARγ对PTEN表达的影响正常对照组人胰腺癌PANC1细胞中,PTEN蛋白表达的百分率为（2.17±0.17）,而加入PPARγ的激动剂罗格列酮处理后,PTEN蛋白表达的百分率明显增高,为（5.81±0.30,P<0.01）;加入PPARγ的抑制剂GW9662处理后,PTEN蛋白表达的百分率降低,为（1.15±0.20,P<0.05,图4）。

　　图4FCM观察PPARγ对PTEN表达的影响（略）

　　Fig4FCMobservetheexpressionofPTENbyPPARγ

　　a:

Normalgroup;b:

Rosiglitazonegroup;c:

GW9662group.

　　3讨论

　　胰腺癌发病率相对低于其他消化系统恶性肿瘤,但其恶性程度高,发展快,是一种预后较差的恶性肿瘤。

近年来,随着对肿瘤发病机制的研究不断深入,发现PPARγ、PTEN与胰腺癌的发生、发展有着密切的联系。

人类胰腺癌主要存在PPARγ的表达[4],人胰腺癌中PPARγ的表达及其作用迄今未完全阐明。

有研究证实激活PPARγ活化后通过多种途径使人类胰腺癌细胞生长停滞于G1期,抑制胰腺癌细胞的生长,对人胰腺癌的生长具有负向调节作用。

Itami等