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江西中医学院

20届毕业论文

论文题目：

吴茱萸对大鼠肝线粒体呼吸功能的影响

课题来源：

国家课题

论文性质：

应用基础研究

学生姓名：

XXXXXX

学生学号：

XXXXXXXXXX

所在班级：

XXXXXXXXXXXXXXXXX院XXXXXXX班

导师姓名：

XXXXXXXXXXXX

导师职称：

XXXXXXXXX

导师电话：

XXXXXXXXXXXX

导师签名：

XXXXXXXXXXXX

实习单位：

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

单位地址：

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

完成时间：

XXXX年XX月

一、论文

1、标题和作者…………………………………………………？

2、中文摘要及关键词…………………………………………？

3、英文摘要及关键词…………………………………………？

4、前言…………………………………………………………？

5、正文…………………………………………………………？

6、讨论或小结…………………………………………………？

7、参考文献……………………………………………………？

8、文献综述……………………………………………………？

9、致谢及声明…………………………………………………？

二、导师评阅意见表（单张）

三、优秀论文申报表（单张）、优秀导师申报表（单张）

四、实习总结（单张）

五、优秀实习生申报表（单张）、优秀实习组申报表（单张）

六、平时成绩表（单张）

吴茱萸对大鼠肝线粒体呼吸功能的影响

吴玉霞（江西中医学院330004）黄丽萍（江西中医学院药学院330004）

中文摘要

目的：

本试验尝试从给药组与空白组表征大鼠肝脏线粒体呼吸功能各指标变化的角度，探索吴茱萸对机体呼吸功能的调控机制，以证实吴茱萸对大鼠肝脏线粒体呼吸功能的影响。

方法：

采用Clark氧电极法测定大鼠肝脏线粒体在密闭反应体系中耗氧的变化，以确定线粒体耗氧速率。

结果：

与空白组比较，给药组有较高的RCR，差异显著。

结论：

吴茱萸组通过加快Ⅲ态呼吸耗氧速率，降低Ⅳ态耗氧速率而提高RCR。

关键词吴茱萸；肝脏线粒体；呼吸功能

ABSTRACT

Purpose:

ToprovetheeffectofEvodiarutaecarpaontherespiratorysystemofmitochondriainmouseliver,theindesofthesehavebeendetected,andalsotheRegulatorymechanism.Methods:

TheClarkoxygenelectrodeisusedtotestthechangeofoxygen,whichconsumedbymitochondriuminmouseliver,tocalculatetherateoftheconsumptionofmitochondrialoxygen.Result:

Comparedwiththeblankgroup,theadministrationgrouphaveahigherlevelofRCR,andthedifferencewasobvious.Conclusion：

EvodiarutaecarpaishelpfultothehigherlevelofRCR,byacceleratingtherateoftheoxygenconsumptionofstateⅢ,andreducingthatofstateⅣ.

Keywords

Evodiarutaecarpa；livermitochondria;respiratorychainfunction

前言

现代实验已证实,寒证的出现可能与人体能量代谢降低有关，由于能量代谢降低，身体热量不足，体温较低，呼吸缓慢，心跳减慢，心搏出量减少，体表毛细血管及小动脉反射性收缩，大脑皮层兴奋性减低而产生上述一系列“寒”的证候[1]。

温里药具有温中散寒、补火助阳、回阳救逆等功效，通过提高能量代谢对于寒证患者有很好的调节作用。

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实，属热性中药代表，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效。

生物能量是维持机体生命的重要物质基础，能量代谢是人体物质代谢的最基本形式。

线粒体是细胞活动的主要供能场所，是物质代谢和能量转化的中心站[2]。

线粒体通过氧化磷酸化（oxidativephosphorylation，OXPHOS）生成大量ATP供应细胞内各种化学反应与功能的能量需要[3]。

本实验尝试从给药组与空白组表征大鼠肝脏线粒体呼吸功能各指标变化的角度，探索吴茱萸对大鼠肝脏线粒体呼吸功能的影响，以期探讨热性中药影响能量代谢的途径与机制。

正文

1试验材料

1.1试验动物健康雄性SD大鼠40只，体重220士20g，由江西中医学院实验动物中心提供。

动物质量合格证编号:

SCXK（赣）2006－0001；将大鼠按随机数字表法分为4组，每组10只动物，分别为吴茱萸20天组、吴茱萸30天组、吴茱萸40天组、空白组。

试验期间动物均饲养于同一环境下，保持室温18～24℃，环境安静，动物随意进食进水，空白组给等体积生理盐水。

所有动物于试验前12h禁食，但自由饮水。

1.2试验药材吴茱萸，购自北京鹤元堂医药科技有限公司。

1.3试验试剂蔗糖（solarbio）、甘露醇（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）、EDTA-2K（国药集团化学试剂有限公司批号：

F20080423）、KCl（上海实验试剂有限公司批号：

200805025）、KH2PO4（天津市福城化学试剂厂批号：

20080913）、Tris（solarbio）、HCL（上海焱晨化工实业有限公司）、线粒体提取试剂盒（碧云天生物技术研究所）、考马斯亮蓝G-250（sigma公司）、琥珀酸钠（sigma公司）、ADP-2Na（sigma公司）、JanusgreenB（sigma公司）、95%乙醇（天津市恒兴化学试剂制造有限公司批号：

20090123）、85%磷酸（天津市恒兴化学试剂制造有限公司批号：

20081203）。

1.4仪器设备782-1ChannelOxygensystem（StrathkelvinInstruments），低温高速离心机（Thermo），-80℃冰箱（Thermo），DY89-Ⅱ型电动匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司），SC-15数控超级恒温槽（宁波新芝生物科技股份有限公司），722型可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司），GilsonP型移液器，SartoriusPB-10PH计，ELGApurelabUHQ超纯水机，分析天平（1/100、1/1000、1/10000、1/100000）（Sartorius）。

2试验方法

2.1实验试剂配置

2.1.1线粒体呼吸功能反应介质：

称取4.0991g的甘露醇、2.5673g蔗糖、0.1211gTris、0.0020gEDTA-2K、0.0373gKCL、0.0680gKH2PO4（PH=7.4）用双蒸水定容至100ml。

2.1.2线粒体提取缓冲液：

称取21.393g蔗糖、0.151gTris、0.101gEDTA-2K；（PH=7.4）用双蒸水定容至250ml。

2.1.3底物（0.4M琥珀酸纳）：

称取1.62g琥珀酸钠用双蒸水定容至25ml。

2.1.450mMADP：

称取0.02365gADP-2Na用双蒸水定容至1ml。

2.2吴茱萸水煎剂的制备

取2.0kg吴茱萸药材，加入10倍量水，浸泡60min，回流提取60min，倒出药液，残渣再加入8倍水，回流提取60min。

合并两次药液，滤过、浓缩后制成吴茱萸水提液，制备成生药浓度为0.42g/ml，放置于-20℃冰箱保存备用。

2.3大鼠肝脏线粒体的制备

2.3.1大鼠实验前禁食12小时,动物麻醉后，迅速手术、切取肝脏组织。

2.3.2肝组织处理：

迅速取出肝脏，移入25ml烧杯加入足量带冰渣生理盐水，将肝组织剪碎，清洗积血以尽可能减少残留血液。

清洗完后迅速用滤纸吸干后用万分之一分析天平称取150mg肝脏组织，将称好的组织转移至预冷的玻璃电动匀浆器中，加入线粒体分离试剂，（注意：

分离试剂要保存在4℃的冰水浴中）。

2.3.3匀浆：

用玻璃电动匀浆器匀浆，（注意：

匀浆器应置于冰水浴中）。

2.3.4离心：

将匀浆分装在2个1.5ml的离心管内，平衡离心，4℃下以600g离心5分钟，此时细胞核，红细胞和细胞碎块及各种细胞器分布在不同层次，轻轻倒出上清装进两个离心管内，（注意：

倾倒时必须小心勿将底部的细胞核倒出以保证所制备线粒体的纯度），平衡后11000rpm离心10分钟，将大部分上清倒出，所得褐色沉淀为最后制备的线粒体。

取少量保存介质，将沉淀悬浮起来，用较大的Tip头缓慢的吹打均匀，操作中尽量避免出现气泡，取样测定蛋白浓度，此为最后制备的线粒体悬液，（整个线粒体制备过程均在4℃进行）。

2.4线粒体活性鉴定

2.4.1JanusgreenB染色原理：

JanusgreenB是对线粒体专一的活细胞染料，具有脂溶性，能跨过细胞膜，解离后，有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜上，内膜上的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈蓝绿色，而在胞质内染料被还原成无色。

有活性的线粒体被染成蓝绿色[4]。

2.4.20.02%JanusgreenB配置:

称取0.02g的JanusgreenB,用生理盐水定容至100ml,装入棕色瓶中。

2.4.5载玻片的制备：

在载玻片上滴一滴线粒体溶液，再滴一滴0.02%JanusgreenB，混匀，然后盖住盖玻片。

2.4.6线粒体活性检测：

将光学显微镜预热20min，再对制备好的载玻片进行观察。

结果显示:

视野中有大量呈蓝绿色游动的颗粒，提示提取的线粒体有较好的活性。

见图1。

图1在光学显微镜40×下观察用JanusgreenB染色的线粒体

2.4线粒体蛋白定量[5]

2.4.1线粒体蛋白含量用Bradford法进行蛋白含量的测定，用标准的牛血清白蛋白作标准曲线，室温下测试。

具体步骤为：

试剂准备：

100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml85%的磷酸，用蒸馏水定容至1L,混匀，用滤纸过滤，4℃保存备用

准备各种不同浓度的牛血清白蛋白标准液，2.5ug/100ul，5.0ug/100ul，10.0ug/100ul，20.0ug/100ul，14.0ug/100ul，每个浓度做三个样，以标准蛋白含量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，作图，即得到一条标准曲线。

见图2。

图2蛋白定量标准曲线

计算待测蛋白样品的浓度。

取4支试管，1支作空白，3支留作测定管，分别加入生理盐水：

100ul、60ul、60ul、60ul，向后3支测定管中加入40ul的线粒体提取液，使每支试管总体积为100ul。

最后各试管中分别加入3.0ml考马斯亮兰G—250染色液，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。

待测蛋白以及标准蛋白中加入3ml中的考马斯亮蓝，用漩涡混合器混匀后静置2分钟，用722型可见分光光度计分别测量其在595nm处的吸光度值。

2.4.2加完试剂后室温下静置2～5分钟后，分别倒入0.5cm光径玻璃比色皿中，用可见分光光度计在波长为595nm处测定各样品的OD值，空白对照为第1号试管，即100ul双蒸水加3.0mlG-250染色液。

2.4.3根据标准曲线方程计算待测蛋白的浓度。

2.5线粒体呼吸功能检测[6]（Strathkelvin782氧电极法）

2.5.1预热生物测氧仪30分钟，恒温30℃。

2.5.2调节氧电极，用保险粉测试电极探头，确保仪器设施良好，可用于样品的测定。

2.5.3在反应槽中加入0.7ml反应介质（75mmol/L蔗糖、225mmol/L甘露醇、0.05mmol/LEDTA-2K、5mmol/LKCl、5mmol/LKH2PO4、10mmol/LTris-HCl）加入反应池中孵育2min，以空气饱和（反应温度28℃），使仪器稳定8～10mins，调节仪器将最大相对氧浓度值设定为20左右。

测定介质量＝反应总体积（2～3ml）－肝脏线粒体悬浮液体积－琥珀酸体积－ADP体积。

2.5.4加入0.1ml肝脏线粒体悬液（含0.1mg线粒体蛋白），记录一段时间基线，1min后加入反应底物10μl（0.5mol/L苹果酸钠、0.5mol/L丙酮酸钠）28℃温浴1min,出现IV态呼吸。

2.5.5记录约两分钟后，加入0.1mol/LADP5μl,出现III态呼吸，记录氧耗曲线，待ADP完全消耗后线粒体又恢复到IV态呼吸。

2.5.6RCR即加入ADP加入后（Ⅲ态呼吸,ST3）和ADP耗尽后（Ⅳ态呼吸,ST4）的氧耗量。

RCR反映线粒体膜的完整性和氧化磷酸化的偶联程度。

P/O值为反应体系中加入ADP的nmol数与相应所消耗的nmol原子氧之比。

2.5.7线粒体呼吸活性以单位时间内每毫克线粒体蛋白消耗多少表示（nmol·min-1·mg-1）。

3结果

3.1大鼠肝脏线粒体呼吸耗氧曲线，见图3。

图3肝脏线粒体呼吸耗氧曲线图

3.1.1吴茱萸对大鼠态3、态4的影响：

见表1，结果表明吴茱萸组能显著加快Ⅲ态呼吸耗氧速率，降低Ⅳ态呼吸耗氧速率，（P<0.01）。

表1吴茱萸对大鼠肝脏线粒体态3、态4呼吸的影响

组别

N

剂量（g生药/kg）

态3（nmolO2/min.mg.pro）

态4（nmolO2/min.mg.pro）

空白组

10

等体积

102.04±16.30

25.53±3.38

吴茱萸20天组

10

4.2

86.87±7.48

16.17±4.52

吴茱萸30天组

10

4.2

66.20±13.49

17.29±3.71

吴茱萸40天组

10

4.2

118.77±21.54△△

28.99±4.73△△

3.1.2吴茱萸对大鼠RCR的影响：

见表2，结果表明给药组RCR高于空白组RCR，可见给药组的能量生成、利用及产热均高于空白组（P<0.01）。

表2吴茱萸对大鼠肝脏线粒体RCR变化的影响

组别

N

剂量（g生药/kg）

RCR

空白组

10

等体积

3.77±0.27

吴茱萸20天组

10

4.2

5.64±1.35△△

吴茱萸30天组

10

4.2

3.96±1.21

吴茱萸40天组

10

4.2

4.09±0.21△△

注：

与空白对照组比较△△P＜0.01

3.2讨论

线粒体是一切生物进行生命活动的动力之源，是所有真核生物进行能量代谢、产生ATP的重要场所[7]。

线粒体的结构、功能变化必将引起其所在细胞的生物活性改变。

要了解它的结构、功能变化就必需进行各种实验研究，首先就需要获得较为完整的线粒体。

线粒体的提取主要是破膜以后使用梯度离心，利用沉降系数的不同获得线粒体。

获得线粒体之后，需要检测线粒体的活性以确保获得的线粒体未受损伤。

通常使用线粒体的呼吸控制率（respiratorycontrolratio）表示线粒体的活性。

呼吸控制率是线粒体呼吸III态（StateIII，有呼吸底物和ADP）和呼吸IV态（StateIV，有呼吸底物，没有ADP）耗氧量的比值[8]。

线粒体的呼吸耗氧偶联着ADP与Pi合成ATP的磷酸化反应，ADP/O值是指线粒体每吸收一克原子氧的同时，生成ATP的克分子数的比值，它反映线粒体的能量转化效率。

呼吸控制率（RCR）与磷/氧（P/O）比值是反映磷酸化活性的重要指标，因而成为反映线粒体呼吸功能的主要指标[9，10]。

本实验研究发现，从呼吸功能指标方面看,吴茱萸组肝线粒体呼吸过程中R3较空白组快,因而使吴茱萸组RCR值（R3/R4）高于空白组，表明给热性中药吴茱萸后能增加肝脏线粒体的有效氧耗。

本实验的结果,考虑可能与以下因素有关:

1、吴茱萸产地不同是否会影响本实验结论2、本实验只研究了时效药物对大鼠肝脏线粒体的影响，缺少不同剂量下药物对大鼠肝脏线粒体的影响，因此，需要增加剂量组进一步考察。

本实验只是呼吸功能研究中的一小部分内容，在研究中尽管选择了一些方法，但与全面反应吴茱萸对机体的作用可能还有一段距离。

有关线粒体呼吸功能的研究还有待进一步探讨。

因此，有意义的呼吸功能的研究及分析方法的建立，在今后的研究中仍然是一个重点和难点。

参考文献

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11-12

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1475．

[3]NewmeyerDD，Ferguson-MillerS．Mitochondria：

releasingpowerforlifeandunleashingthemachineriesofdeath．Cell，2003，112：

481-490．

[4]潘家秀.蛋白质化学研究技术[M].北京:

北京科学技术出版社，2001，22.

[5]BradfordM.Anal.Biochem.1976,72:

248

[6]张桦，焦选茂，刘树森.缺血再灌注对大鼠心肌线粒体电子传递与质子泵出偶联的影响[J].中国病理生理杂志.1993，9（5）:

561一563.

[7]仇万山陈亦江,线粒体结构、功能和常用研究方法.国际麻醉学与复苏杂志2007,28-3

[8]CawthonD，BeersK，BottjeWG．Electrontransportchaindefectandinefficientrespirationmayunderliepul——monaryhypertensionsyndrome（ascites）一associatedmito—chondrialdysfunctioninbroilers[J]．PoultSci，2001，80（4）：

474．

[9]OliveiraCP。

CoelhoAM，BarbeiroHV，ela1．Livermi—tochondrialdysfunctionandoxidativestressinthepatho—genesisofexperimen|alnonalcoholicfattyliverdisease[J]．BrazJMedBiolRes，2006，39

（2）：

189．

[10]刘锐，黄慧玲.亚低温治疗颅脑创伤大鼠脑线和凋亡相关基因表达变化的研究[J]，2007，5:

10-10.

文献综述

寒热症与能量代谢

吴玉霞（江西中医学院330004）黄丽萍（江西中医学院药学院330004）

摘要：

寒热是八纲中重要的两个方面，不少人对寒体和热体在能量代谢方面的差异和影响进行了研究。

观察寒、热药性中药对正常大鼠及寒、热症动物大鼠线粒体能量代谢的影响，研究其可能的作用机制，以及从线粒体能量代谢的角度阐释寒热药性的现代内涵。

本文从寒热症与机体能量代谢的关系、寒热症在能量代谢上的研究进展、以及展望三方面进行了阐述。

关键词：

寒热症；能量代谢

1.寒热症与机体能量代谢的关系

有研究表明，热证时机体内物质代谢特别是分解代谢亢进，能量代谢增高，生热效应加强；寒证时则相反，机体内物质代谢特别是分解代谢受到抑制，生热效应降低，能量产生不足。

寒症的主要表现是：

体温低，畏寒，口不渴，小便清长，大便稀溏，脉迟缓或沉细无力。

寒症的出现可能与人体能量代谢降低有关，由于能量代谢降低，身体热量不足，体温较低，呼吸缓慢，心跳减慢，心搏出量减少，体表毛细血管及小动脉反射性收缩，大脑皮层兴奋性减低而产生上述一系列“寒”的证候。

热症的主要表现是：

发热，手足温暖，不恶寒反恶热，口渴饮水多，喜欢冷饮，小便短赤，大便秘结，面色红，舌色红苔黄，脉数或脉洪有力。

热症的病理生理基础可能与能量代谢增高有关，由于能量代谢增高，体温升高，呼吸增快，心搏出量增加，皮肤血管舒张，血流加快，以及皮肤表面和呼吸器官蒸发水分增多，因而引起一系列热的症候[1]。

早在上世纪60年代徐上林[2]根据临床报导指出，寒症或阳虚症患者基础代谢率偏低；热症阴虚证病人基础代谢率偏高。

寒症患者神经类型多为抑制型，热症患者偏于兴奋型。

梁月华[3]等发现寒症患者体温、心率、呼吸频率、血压等均有不同程度的下降，唾液量则增加，植物神经平衡指数降低，尿内CAs、17-OHCS排出量减少；而热症患者体温、心率、呼吸频率和血压均有所上升，唾液量尊，植物神经平衡指数升高，尿CAs、17-OHCS排出量明显增加。

张伟荣等[4]采用肝脏ADK活性和细胞能荷作为反映能量生成状态的指标，肝Na+-K+-ATP酶作为能量利用状态的指标，对寒、热体大鼠进行能量代谢方面的研究，结果显示：

热体组ADK活性比寒体组、正常组均高；热体大鼠的肝匀浆Na+-K+-ATP酶活性比寒体大鼠高。

可见，热体的能量生成、利用及产热均比寒体高。

陈群[5]等观察热症模型大鼠肝细胞线粒体SDH的变化，结果表明：

热症时SDH活性升高，提示此时机体的能量代谢处于亢盛状态，即热证与机体能量代谢变化趋势呈正相关。

《神农本草经》中指出“疗寒以热药，疗热以寒药”，药物的寒热特性对机体会产生不同的生物效应。

寒性药消除机体“热”的病症,热性药消除机体“寒”的病症。

寒、热中药或其有效成分可通过影响线粒体能量代谢的某些环节,实现其对机体能量代谢的调节。

如丁安荣[6]等证明大黄、栀子等也具有抑制Na+-K+-ATP酶活性作用；相反,温热药淫羊藿则被证实能够使Na+-K+-ATP酶活性回升，并能对抗地塞米松引起的Na+K+-ATP酶“耗竭”现象。

寒热中药或其有效成分可以通过作用于多个环节对于机体线粒体能量代谢产生影响[7-9]。

3.寒热证在能量代谢上的研究进展

能量代谢（energymetabolism）[10]，顾名思义就是生物体内物质代谢过程中所伴随的能量释放、转移和利用，在分解代谢过程中，营养物质蕴藏的化学能便释放出来，这些化学能经过转化，便成了机体各种生命活动的能源，所以说分解代谢的放能反应。

机体所需的能量来源于食物中的糖、脂肪和蛋白质。

这些能源物质分子结构中的碳氢键蕴藏着化学能，在氧化过程中碳氢键断裂，生成CO2和H2O，同时释放出蕴藏的能。

这些能量的50％以上迅速转化为热能，用于维持体温，并向体外散发。

其余不足50％则以高能磷酸键的形式贮存于体内，供机体利用。

体内最主要的高能磷酸键化合物是三磷酸腺苷（ATP）。

　　生理状态下的机体“寒”、“热”状态反映了能量生成和能量利用之间的平衡关系，其中主要是ATP的生成，利用和产热作用，多种激素对此有调节作用。

张伟荣等[11]的实验采用肝脏ADK活性和细胞能荷作为反映能量生成（主要是ATP生成）状态的指标，肝Na+-K+-ATP酶活性为能量利用（主要是ATP利用及产热）状态的指标并观察了多种激素的水平，以期发现一些规律性的变化。

D·E·Alkinson曾指出，细胞的能态及其变构调节物的均衡可用细胞的能量载荷表示，是细胞能量生成和利用的平衡状