重组抗体药物的质量控制解析.docx

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重组抗体药物的质量控制解析

Ｃｈｎｓ　ｏＵａ　ｆＮＷ　ｒｇ　０１，０１　ｉｅｅＪｍＩ　ｅＤｕＳ２１２（９）Ｏ存活细胞的量效关系进行４参数拟合后，算其　计Ｅ　并与标准品比较后即可评价抗体的相对活性。

Ｃ　而表皮生长因子受体（ＧＲ）抗的生物学活性测　ＥＦ单定则是采用细胞增殖抑制方式，即通过特异结合并　封闭表皮生长因子受体，有效抑制肿瘤细胞生长，并　通过供试品与标准品的梯度稀释获得增殖抑制的量　效曲线，计算重组抗体的生物学活性。

并　３２１３报告基因法　报告基因法也是通过重组　．．．片可固化可溶性的抗原和细胞，待测抗体通过微液流　系统流经芯片时，一旦与固化抗原结合，片表面的蛋　芯白浓度就会增加，进而引起芯片表面液体折射率的变　化而被检测到。

ＢＡ技术的优势还在于能实时动态监　Ｉ测抗原抗体的结合反应，并测定亲和常数等反应参数。

　３３残留杂质　．　重组抗体一般由哺乳动物细胞表达生产，因此　需要对制品中来自表达体系及纯化过程中可能存在　的外源组分进行限量控制。

根据其生产工艺，相关　抗体与相应靶点结合后，定信号通路变化效应的　测活性评价方式。

一般在细胞株难于获得，以及杀伤　杂质的限量控制主要包括残余ＤＡ、Ｎ残余宿主细胞　蛋白、留蛋白Ａ等。

其中针对宿主细胞蛋白、残蛋　白Ａ亲和纯化柱的配基）（的残留限量检测主要采　用夹心ＥＩＡ的方法。

ＬＳ　中和或增殖抑制法产生量效曲线的信噪比不理想　时，基于对该通路的现有了解，携带抗体作用靶　可将点反应元件与报告基因的质粒稳定转染细胞后，通　过重组抗体与相应靶点的作用，动报告基因的表　启达来检测重组抗体的生物学活性。

如在ＶＧＥＦ单抗　的活性测定中，携带ＶＧ将ＥＦ受体和萤光素酶报告　基因的质粒共转染２３细胞，９筛选后得到稳定携带　上述质粒的细胞。

当ＶＧＥＦ与该重组细胞膜上的受　传代细胞系的ＤＡ理论上具有致瘤性的潜在　Ｎ风险，ＤＦＡ将生物制品可以允许的残余ＤＡ限度　Ｎ规定为每剂量不超过１０Ｐ　，国也规定须用敏　０　ｇ我感的方法测定来源于宿主细胞（括转化的哺乳动　包物传代细胞）的残余ＤＡ含量　，限量规定为每　Ｎ其剂量小于１０Ｐ。

目前残余ＤＡ的检测方法主要　０　ｇＮ包括杂交、光染色、量ＰＲ等方法　荧定Ｃ。

杂交　法主要采用地高辛等非放射性材料标记核酸探针，无　需特殊仪器设备，在实际工作中通常需要对供试品　但及ＤＡ标准进行蛋白酶消化等同步处理，Ｎ会造成检　体结合后，可通过胞内结构域的变构与相应信号通　路的作用，活化萤光素酶报告基因的表达。

将系列　梯度稀释的供试品与标准品与一定浓度的ＶＧＥＦ孵　育后，与该重组细胞共培养即可获得ＶＧＥＦ单抗的　活性量效曲线。

Ｉ一Ｂ单抗也采用了携带类似报告　Ｌ１基因的细胞株进行活性测定。

　测灵敏度的降低。

荧光染料法采用ＰｃＧｅｎ等可特　ｉｒｅｏ异与双链ＤＡ形成复合物的荧光染料　，Ｎ以荧光酶　标仪检测，根据标准曲线与供试品的荧光强度，算　计ＤＡ残留量。

该方法简便快捷，由于抗体药物残　Ｎ但余ＤＡ质控标准较高和检测限的原因，光染色法　Ｎ荧通常不适用于抗体药物的ＤＡ残量控制。

Ｎ　３４重组抗体药物的成品质控　．重组抗体药物的成品除含量、生物学活性及必　３２２重组抗体的结合活性测定　．．３２２１ＥＩＡ法．．．　ＬＳ竞争ＥＩＡ是最常用的重组　ＬＳ抗体结合活性测定方法。

首先将制备的可溶性抗原　包被后，系列梯度稀释的供试品、将标准品与一定浓　度的酶标抗体竞争结合包被抗原，抗体浓度与吸　将光值的量效关系进行４参数拟合后，算供试品、计标　准品的Ｅ５Ｃ０值评价重组抗体的结合活性。

　３２２２流式细胞仪法　该方法原理与竞争　．．．　ＥＩＡ相同，ＬＳ只是以带有特异结合位点或膜表面标　记分子的细胞替代了包被的可溶性抗原或受体，通　过流式细胞仪测定阳性细胞率来检测竞争结合的效　要的理化特性检测外，还应该按照注射剂的要求，进　行其他常规项目的检测，括鉴别试验、观、见　包外可异物、量、分、Ｈ值、菌检查、菌内毒素检　装水ｐ无细查、常毒性检查等，体测定方法参见现行《异具中华　人民共和国药典》及其他相关技术文件。

　４重组抗体药物未来需要开展的工作　　果。

该方法避免了相应抗原的制备过程，难于获　对得可溶性抗原的重组抗体可采用该方法进行结合活　性测定，同时细胞表面抗原的空间结构近乎于天然　存在形式，其测定结果应更加客观。

　３２２３ＢＡ法　．．．　Ｉ基于ＳＲ的ＢＡ法测定周　ＰＩ我国重组抗体药物的质量控制技术随着抗体药　物研发的深入也在不断的发展和完善。

未来抗体药　物质控仍需进一步关注以下几个主要方面。

　４１生产细胞的质量控制　．　目前现行版药典关于细胞库管理和检定要求，　期短、测样品消耗量少，待该方法在测定抗原抗体结　合活性时无需标记，免了标记对分子结构的影响，避　可更加真实地反映抗原抗体的结合情况。

其检测芯　经多年的实践证明可以保障重组抗体等生物技术药　１５　８３中国新药杂志２１年第２０１Ｏ卷第１９期　

Ｃｈｎｓ　ｏｕｎ　ｆＮｗ　ｕｓ２１２１）ｉｅｅＪ　ａｌ　ｅＤｒｇ　０１，０（９　ｒｏ物生产细胞株的总体质量，作为逆转录病毒检测　但常用方法的逆转录酶活性测仍有待进一步完善，即　法。

如采用商用试剂盒，专属性、测限、收率　其检回等参数需经验证通过后方可使用。

　由于重组抗体药物剂量大，杂交法、光染色法　荧虽然可以通过增加标准品回收率、检样品中核酸　待需建立均一、稳定的ＲＡ模板和逆转录酶活性标准　Ｎ品，并采用诸如定量ＰＲ等方法进行酶活性定量。

Ｃ　４２重组抗体结构分析　．富集等前处理步骤，对制品中的核酸残量进行控制，　但由于方法的局限性仍需进一步完善。

而定量　ＰＲ方法在特异性、敏度、确性方面具有独特　Ｃ灵准的优势，比较客观地对残余ＤＡ定量，且反映　可Ｎ并片段的相对分子质量分布。

但该方法仍需要对引物　设计、准品等做进一步的优化与规范。

同时残余　标ＤＡ的检测也需要结合工艺验证来综合控制。

Ｎ　５结语　　质谱仪、细管电泳仪、型高效液相系统等新　毛新型仪器的应用，可有效提升抗体质控中结构分析的　水平。

例如国外研发单位在重组抗体理化对照品充　分研究、定的基础上，鉴已在重组抗体肽图的质控　中，质控标准从对翻译后修肽段的定性分析提高　将为定量检测，由于各种条件的制约，而目前我国重组　抗体药物质控理化对照品的研究还不够详尽，且　并质控标准中肽图分析结果仅要求与对照品一致。

同　时重组抗体翻译后修饰的糖链十分复杂、且其结　并如何更加科学有效地对重组抗体药物的质量进　行控制，需要结合临床评价及上市后的安全性监　还测，一步对质控方法学、进相关标准物质开展深入研　究。

本文对国内外有关重组抗体药物的质量控制研　究进展和亟待解决的问题进行综述，旨在抛砖引玉，　引发大家对相关问题的关注和讨论。

　志谢：

谢中国食品药品检定研究院重组技术产品室饶　感春明研究员对于本文提供的相关资料及修改意见。

　［参　考　文　献　］　　ＲＴＲ　Ｓ，ＡＲ　ＡＨＯＥＡＭＨＴＥＲ．Ｑａｔｂ　ｅｉｎｆｒｂｏｈｒａ　ｕｌｙｙｄｓ　ｏ　ｉｐａｍ—ｉ　ｇ］　］　］　］　Ｉ构与生物学功能相关，因此糖基化分析十分具有挑　战性，因此也是抗体质量控制的重点和难点。

目前　虽然可以采用质谱等分析手段对唾液酸、糖图谱　寡和糖基化位点进行分析，反映一定的糖基化信息，并　但目前没有一种简便易行的方法，快速地对糖链　能的结构进行全面的分析和鉴定。

　４３重组抗体生物学活性检测　．抗体活性检测方法因其功能各异而具有多样　性，常于体外采用细胞评价模型模拟其作用机制　通产生量效反应进行，在实际工作中，些活性检测　但有周期较长，骤繁琐、响因素多，步影重复性不理想，并　且有些重组抗体药物无法找到合适的细胞株进行活　性测定，进而采用抗体结合活性作为其功能性评价　指标。

针对上述有待进一步完善的环节，基于对　可胞内信号传导通路的了解，建相应的转基因细胞，构　以期建立更加准确、用和便捷的活性测定方法。

耐　另一方面，目前抗体生物学活性测定标准主要是以　ｃｕｉｌ，ｒｃｐｅ　ｎ　ａｅｓｄｅ［．Ｊｈ　ｌｙ＆Ｓｎ，ｅｔａｓｐｉｉｌａｄｃｓｔｉｓＭ］ｏｎＷｉｃｎｓ　ｕｅｏｓ　２０１　０９：

．国家食品药品监督管理局药品审评中心．重组制品生产用哺乳　动物细胞质量控制技术评价一般原则［ＢＯ．［０６一ｌ］Ｅ／Ｌ］２０Ｏ．　ｈｔ／ｗｗｗ．ｄ．ｒ．ｎｚｙ．ｏｍｅｈｄ＝ｌｒｅａｅｄ＝５　ｔｐ：

／ｃｅｏｇｃ／ｄｚｄ？

ｔｏａｇＰｇ＆ｉ９．Ｄｅｉａｉｎａｄｃａａｔｒａｉｎｏ　ｅｌｓｂｔｔｓｕｅ　ｒｐｏｕ—ｒｔ　ｎ　ｈｒｃｅｉｔ　ｆｃｌｕｓｒｅ　ｓｄｆ　ｒｄｃ　ｖｏｚｏ　ａｏｔｎｏ　ｉｔｃｎｌｇａｂｏｏｉｌｒｄｃｓＥ／Ｌ］１９　ｉ　ｆｏｅｈ０ｉｌｉｌｃ　ｏｕｔ［ＢＯ．［９７一ｏｂｏｃ／ｇａｐＯ７—１］ｔ：

／ｗｉ．ｒｆｅｄｉ／Ｐｂｉｗｅ—ｉ／Ｃ—６．ｈｐ／ｗｗ．ｈｏｓｉａｍｎｕｌ—ｂＳｅＩＨ　ｔｃ／ｌｃｔＰｏｕｔＧｉｅｎｓＱａｉ／５／ｔ４ＱＤＧｉｅｎ．ｄ　ｒｃ／ｕｄｌｅｕｌｙＱＤＳｐ／５＿ｕｌｅｐｆｄｓｉ／ｔｅｄｉＦｏｄａ　ｕ　ｍｉｉｔｔｎＣｎｅ　ｒＢｏｏｉｓＥａｕｔｎａｄｏ　ｎｄＤｒｇＡｄｎｓｒｉ　ｅｔｒｆ　ｉｌｇｃ　ｖｌａｉ　ｎ　ａｏｏｏＲｅｅｒｈ：

ｔｅｄ．Ｐｉｔ　ｏｃｎｉｅ　ｎｔｅｃａａｔｒｚｔｎｏ　ｓａｃＢｅｈｓａｏｎｓｔ　ｏｓｄｒｉ　ｈ　ｈｒｃｅｉａｉ　ｆｏ相对于标准品活性的百分含量体现的，是一个相　即对生物学活性结果，能够借鉴其他生物学技术药　如物质控经验，重组抗体药物的生物学活性单位进　对行科学的赋值和定义，加强标准物质稳定性的研　并ｃ１ｌｅ　ｓｄｔ　ｒｄｃ　ｉｌｇｅｌ『．ＭＤ，Ａ：

９７ｅ１ｉｓｕｅ　ｏｐｏｕｅｂｏｏｉａｓＳ］　ｎＵＳ１８　　国家药典委员会．中华人民共和国药典（部）Ｓ．２Ｉ三［］ＯＯ年　版．北京：

国医药科技出版社，００：

５　中２１１．国家药典委员会，中华人民共和国药典（部）Ｓ．２１三［］００年　版．北京：

国医药科技出版社，００１中２１：

６—１．７　张岩锐，丽娟，段苟凝虹，．重组Ｃ—２等ＨＯＣ８细胞染色体鉴定　方法的研究［］Ｊ．微生物学免疫学进展，０６３（）４４　２０，４４：

０—３国家食品药品监督管理局药品审评中心．生物组织提取制品　和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则　［ＢＯ］［０５—１］ｔ：

／ｗｃｅｏｇｅ／ｄｚｄ？

Ｅ／Ｌ．２０２．ｈｔ／ｗｗ．ｄ．ｒ　ｎｚｙ．ｏ　ｐｍｅｈｄ＝ｌｒｅｇ＆ｉ＝５　ｔｏａｇＰａｅｄ３．究，可以更加客观有效地评价重组抗体产品的有　将效性，同时也便于类似抗体产品之间的比对研究。

　４４重组抗体残留杂质分析　．在重组抗体质控中，要对宿主细胞蛋白、白需蛋　Ａ残留进行限量控制。

虽然抗体生产中主要采用　ＣＨＯ细胞和蛋白Ａ，各单位细胞株、产工艺均　但生非一致，因此研发单位应根据各自的生产工艺制备　相应的残量控制对照品、体，建立相应检测方　抗并１５　８４国家药典委员会．中华人民共和国药典（部）Ｓ　２１三［ｊ０Ｏ年　版．北京：

国医药科技出版社，００１．中２１：

９　周海钧．药品生物检定［．北京：

民卫生出版社，０５　Ｍ］人２０：

１３—１２．６７　中国新药杂志２１０１年第２０卷第１９期　

Ｃｈｎｓ　０ｕｎｌｆＮｗ　ｒｇｓ２１，０（９）ｉｅｅ３　ａ　　ｅＤｕ　０１２１　ｒｏ王军志．生物技术药物研究开发和质量控制［．第２版．Ｍ］　北京：

学出版社，０７：

３科２０１８—１０　４．［２　Ｑａｉ　ｆｉｅｈｏｏｉｌｒｄｃ：

ｔｂｌｙｔｓｎ　ｆｉｔｃｎ。

１］ｕｌｙｏ　ｏｃｎｌｇｃ　ｏｕｔｓｉｔｅｔｇ　ｏｈｏｔｂｔａｐｓａｉ　ｉｏｂｅ　ｌｉＩｂ０ｇａｐｏｕｔ［ＢＯ．［９５—１０ｃ／ｉ０ｉｌｒｃｓＥ／Ｌ］１９ｇａ１ｃ　ｄ　１—３．ｈ—０］ｔ　ｔ／ｗｗ．ｃ．　／ｉａｍｉ／ｕｌＷｅＳｔ／Ｉ—Ｐｏｕｔ／ｐ：

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学出版社，０７１２—１７　科２０：

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