微生物试题3.docx

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微生物试题3

生化试验

1、糖醇类代谢试验：

（一）糖醇类发酵试验

（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验

（三）V-P试验

（四）甲基红（M.R.）试验

（五）七叶苷水解试验

（六）甘油品红试验

2、氨基酸和蛋白质代谢试验：

（一）靛基质（吲哚）试验

（二）H2S试验

（三）尿素酶试验

（四）氨基酸脱羧酶试验

（五）苯丙氨酸脱氨酶试验

（六）明胶液化试验

3、有机酸盐和铵盐的利用试验：

（一）枸橼酸盐（柠檬酸盐）利用试验

（二）丙二酸盐利用试验

4、呼吸酶类试验：

（一）氧化酶试验

（二）过氧化氢酶类试验

（三）硝酸盐还原试验

（四）氰化钾试验

5、毒性酶类试验：

（一）溶血试验

（二）链激酶试验

（三）卵磷脂酶试验

（四）血浆凝固酶试验

六、三糖铁（TSI）试验

1、概述

（1）什么是生化试验？

指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。

（2）检验细菌的生化试验范围

1、糖醇类代谢试验

2、氨基酸和蛋白质代谢试验

3、有机酸盐和铵盐的利用试验

4、呼吸酶类试验

5、毒性酶类试验

6、三糖铁（TSI）试验

（3）生化试验的方法

1、培养物应加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的PH值变化。

2、培养物中应加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。

3、根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。

4、根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。

（4）生化试验的注意事项

1、待检菌应是新鲜培养物，培养18---24小时。

2、待检菌应是纯种培养物。

3、遵守观察反应的时间，观察结果的时间，多为24小时或48小时。

4、应作必要的对照试验。

5、提高阳性检出率，至少挑取2---3个待检的疑似菌落分别进行试验。

2、糖醇类代谢试验

（一）糖醇类发酵试验

1、原理：

不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同。

有的能分解多种糖醇，有的能分解1---2种糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。

2、试验方法：

用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针穿刺接种。

置36±1℃培养1---3天，每天观察结果。

3、结果观察与记录：

①产酸不产气，阳性，以“+”表示；

②产酸产气，阳性，以“

”表示；

③不产酸不产气，阴性，以“-”表示。

（2）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验

1、原理：

①细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。

♫氧化性细菌在有氧条件下才能分解葡萄糖，无氧条件不能分解葡萄糖；

♫发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖。

②不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。

③根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。

2、试验方法：

取待检菌，以穿刺接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2---4天，每天观察结果。

3、结果观察与记录：

略

（3）V-P试验

1、原理：

某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇；后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称为V-P（+）反应。

2、试验方法：

①奥梅拉法

②贝立脱法

③快速法

3、结果观察与记录：

①发酵管出现红色者，为阳性，记V-P+

②发酵管顶部出现黄色或铜绿色者，为阴性，记V-P-

（4）甲基红（M.R.）试验

1、原理：

细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至PH4.5以下，使甲基红试剂变红，为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液PH>5.4，甲基红指示剂呈橘黄色，为甲基红试验阴性。

2、试验方法：

挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1或30℃（以30℃较好）培养3---5天，从第48h起，每次取培养液1ml，加入甲基红指示剂1---2滴，立即观察结果。

3、结果观察与记录：

①呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR+

②呈橘黄色或黄色为阴性，记MR-，迄至发现阴性并培养至第五天仍为阴性，即可判定结果。

（5）七叶苷水解试验

（6）甘油品红试验

三、氨基和蛋白质试验

（一）靛基质试验（吲哚试验）

1、原理：

某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。

吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。

2、试验方法：

将待检菌接种于培养基中，于36±1℃培养24---48h后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性，或沿试管壁缓慢加入欧波试剂约0.5ml覆盖液面，两液面接触处呈现玫瑰红色者为阳性反应，无红色者为阴性反应。

3、结果观察与记录：

①呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+

②无红色者，为阴性反应，记-

（2）H2S试验

1、原理：

某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。

2、试验方法：

挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养基上，于36±1℃培养24---48h,观察结果。

3、结果观察与记录：

①培养基底部呈黑色，为阳性，记+

②培养基底部无黑色，为阴性，记-

（3）尿素酶试验

1、原理：

某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性，以此鉴别细菌。

2、试验方法：

挑取大量培养18---24h的待检菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。

培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变为阴性。

如阴性继续培养至4天，作最终判定。

3、结果观察与记录：

①培养基变呈粉红色，为阳性，记+

②培养基颜色不变，为阴性，记-

（四）氨基酸脱羧酶试验

1、原理：

某些细菌能产生氨基酸脱羧酶，可使赖氨酸、鸟氨酸进行脱羧作用，生成胺类物质和CO2。

胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性，如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。

阳性反应试验管颜色变化：

紫色→黄色→紫色

原理：

对照管呈黄色，说明细菌生长。

在培养的早期（10---12h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，PH又回升至碱性，指示剂显紫色。

2、试验方法：

取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在36±1℃培养1---4天，每天观察结果。

3、结果观察与记录：

①试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记+

②试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记-

（5）苯丙氨酸脱氨酶试验

1、原理：

某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。

2、试验方法：

略

3、结果观察与记录：

①试验管立即出现绿色，为阳性，记+

②无色为阴性，记-

（6）明胶液化试验

四、有机酸盐和铵盐的利用试验：

（一）枸橼酸盐（柠檬酸盐）利用试验

1、原理：

某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼（柠檬酸盐）生成碳酸盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，是培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。

2、试验方法：

挑取待检菌，在枸橼酸盐培养基涂面上密集划线接种在36±1℃培养1---4天，每天观察结果。

3、结果观察与记录：

斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记为+

无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记为-

（二）丙二酸盐利用试验

1、原理：

某些细菌能利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源，丙二酸盐被分解成碳酸钠，使培养基变为碱性，培养基由绿色变为蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。

2、试验方法：

取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸盐培养基上，于36±1℃培养48h，观察结果。

3、结果观察与记录：

培养基由绿色变为蓝色，为阳性，记为+

培养基无颜色变化，为阴性，记为-

五、呼吸酶类试验：

（一）氧化酶试验

（二）过氧化氢酶类试验

（三）硝酸盐还原试验

1、原理：

某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯环酸与α-萘胺作用，生成红色化合物。

2、试验方法：

取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在36±1℃培养1---4天，每天取2ml培养液，加入A、B试剂的等量混合物各两滴混匀，立即观察结果。

3、结果观察与记录：

呈红色，为阳性，记为+

若无红色出现，为阴性，记为-

（四）氰化钾试验

1、原理：

氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂，可与呼吸酶作用使酶失去活性，抑制细菌的生长，但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长，以此鉴别细菌。

2、试验方法：

取培养20---24h营养肉汤培养液或菌落一环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，于36±1℃培养24---28h。

3、结果观察与记录：

对照管有菌生长，试验管有菌生长，为阳性，记为+。

对照管有菌生长，试验管无菌生长，为阴性，记为-。

6、毒性酶类试验：

（一）溶血试验

类型及现象：

α（甲型）溶血：

菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。

β（乙型）溶血：

菌落周围出现较宽的透明的溶血环。

γ（丙型）溶血：

菌落周围无溶血环。

（二）链激酶试验

原理：

A群链球菌群能产生链激酶，该酶能使血液中的纤维蛋白酶原变为纤维蛋白酶，而后溶解纤维蛋白，使血凝块溶解，为阳性反应。

（此试验用于测定链球菌的致病性，阳性反应具有致病。

）

（三）卵磷脂酶试验

（四）血浆凝固酶试验

1、原理：

致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的凝固蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块，或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象，为阳性。

2、试验方法：

玻片法：

取清洁干燥的载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别于生理盐水和血浆混匀，5min内，若血浆内出现团块或颗粒状凝块，而生理盐水中仍呈均匀混浊，则为阳性；如两者均匀混浊无凝块，则为阴性。

试管法：

略

七、三糖铁（TSI）试验

原理：

如果细菌可利用蔗糖或乳糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄，如果只可以利用葡萄糖，葡糖糖被分解产酸，可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸因接触空气而被氧化，加之细菌利用培养基含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。

如果细菌又能分解含硫化合物，产生H2S，培养基底部变黑。

一、抗原与抗体

（一）抗原

1、抗原的概念

是一类能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞（免疫原性），并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质（免疫反应原性）。

2、抗原的特性

免疫原性

免疫反应性

（二）抗体

概念：

抗体是由抗原刺激人体或动物的淋巴细胞，由淋巴细胞转化为浆细胞所产生的具有特异性的免疫球蛋白。

（三）抗原抗体反应

概念：

是指抗原与抗体之间发生的特异性结合反应，可发生于体内，也可发生于体外。

2、血清学反应

（一）概念

指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，所出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。

（二）反应的特点

1、具有特异性与交叉性；

2、具有敏感性；

3、具有定理特性；

4、反应的两个阶段性；

5、反应的稳定性与可逆性；

6、最适比和现象。

（三）影响因素

1、抗原

2、抗体

3、环境因素：

电解质：

0.85%NaCl;温度：

37℃或56℃;

PH值：

7.0;

反应时间;

振荡：

适当的机械振荡。

（四）反应的种类

1、凝集反应

2、沉淀反应

3、中和反应

4、标志抗体技术

（五）凝集试验

1、方法

直接凝集法间接凝集法抗球蛋白试验

Δ玻片凝集法：

（直接凝集试验的一种）

（1）原理：

用已知抗体作为诊断血清，来检测未知抗原，以此来鉴定相应抗原。

（2）方法步骤：

于洁净玻片的一端加诊断血清一滴、另一端加生理盐水作为阴性对照。

用接种环取待检菌或血细胞悬液分别涂于诊断血清和生理盐水中。

轻轻转动玻片，使其充分混匀，静置数分钟，观察结果。

（3）试验结果：

若诊断血清一端有凝集现象，生理盐水一端无凝集，为阳性。

若两端均无凝集现象，为阴性。

鲜血者红细胞

受血者血清

O型（抗A、抗B）

A型（抗B）

B型（抗A）

AB型（无）

O型

-

-

-

-

A型

+

-

+

-

B型

+

+

-

-

AB型

+

+

+

-

例“+”表注：

注:

“+”表示有凝集反应，“-”表示无凝集反应。

（4）诊断血清及类型

诊断血清：

将已知的抗原注射于动物体，使其产生相应的抗体，采出动物的血液，分离出含有大量抗体的血清，称为诊断血清。

抗O血清：

用菌体抗原（O抗原）免疫动物后所得的血清。

抗H血清：

用鞭毛抗原（H抗原）免疫动物后所得的血清。

表面抗原血清：

用含有表面抗原的菌体免疫动物后所得的血清。

多价诊断血清：

用含有两种（型）的菌体免疫动物后所得的血清。

单价诊断血清：

只含有一种（型）特异性抗体的血清。

因子诊断血清：

把含有多种抗体的混合免疫血清，用具有共同抗原成分的有关细菌将其共同抗体吸收，只留下一种或几种所需的特异性抗体的血清。

复习题

1、什么是生化试验？

2、做生化试验要注意哪些事项？

3、简述糖醇类试验的原理，写出其试验方法和结果的记录。

4、简述甲基红试验的原理，写出其试验方法和结果的记录。

5、葡萄糖氧化发酵试验的原理。

6、VP试验的原理。

7、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项。

8、简述硫化氢试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项。

9、简述尿素酶试验的原理，写出其试验方法、结果的记录。

10、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出试验结果的记录、阳性试管颜色变化过程和原理。

11、简述氰化钾试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项。

12、写出溶血试验的溶血类型及现象。

13、简述链激酶试验的原理。

14、简述血浆凝固酶试验的原理，并写出玻片法的试验方法。

15、简述三糖铁（TSI）试验的原理。

16、影响血清学试验的因素有哪些?

17、血清学试验常用的电解质有哪些,有什麽作用?

18、写出血清学试验中玻片凝集法的原理和试验的方法步骤.