小细胞肺癌标记物.docx

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小细胞肺癌标记物

小细胞肺癌标记物——proGRP酶免测定试剂盒使用说明

前言

促胃泌素释放肽（gastrinreleasingpeptide；GRP）是1978年由McDonald等从猪的胃组织中分离出来的，具有促胃泌素分泌促进作用。

由27个氨基酸组成的脑肠肽。

人的GRP遗传子是在1984年克隆成功的。

由于细胞产生三种不同的GRPmRNA，从而合成C末端不同结构的三种GRP前体（proGRP）。

但其活性结构均相同。

肺癌与GRP的关系，是1978年在人胚胎肺内分泌细胞中发现存在bombesin免疫活性后开始认识到的。

1983年，日本国立癌中心的山口等自该内分泌细胞的发生分化着手，认为小细胞肺癌癌细胞可能分泌GRP，其后证明，GRP是小细胞肺癌的重要产物。

即而又证明了血中GRP试小细胞肺癌的重要标志物。

同时证明，使用ProGRP作为抗原，利用RIA法分析血中ProGRP，亦可作为临床用小细胞肺癌的肿瘤标志物。

本试剂盒是以国立癌中心为主，由东燃株式会社和TERUMO株式会社共同开发的酶免测定法试剂盒。

本试剂盒采用了三种ProGRP的结构相同部分之单克隆抗体，因此具有高灵敏度，尤其在小细胞肺癌时显示出较高的值，从而可区别肺部其他肿瘤和各种良性疾患，因此是特异性极高的试剂盒。

终上所述，本试剂盒可以检测出用X线或其他方法不能发现的早期小细胞肺癌，因此可作为小细胞肺癌早期诊断的辅助手段。

特点

（1）高亲和性单克隆抗体的使用使本试剂盒具有高灵敏度和高特异性。

（2）因采用固相酶标板，所以适用于大量样品的处理。

（3）操作简单。

测定原理

本试剂盒采用酶标板固相EIA夹心法原理

（1）一次反应

酶标板内预包被抗ProGRP单抗与样品中的ProGRP结合形成抗原——抗体复合物。

（2）二次反应

将未反应物洗涤去除后，加入POD标记抗体，与上述复合物结合。

（3）显色反应

将未反应物洗涤去除后，加入OPD（邻苯二胺）底物液进行显色。

（4）测定

在490-495nm波长段）或490-495\600-700nm）进行吸光度测定，使用试剂盒提供的ProGRP标准品作出标准曲线，再求出被测样品中的ProGRP浓度。

（5）判定结果

将上述求出的ProGRP浓度与临界值进行比较，其结果即可作为诊断小细胞肺癌的辅助。

试剂盒组成

本产品由下述试剂所组成

（1）抗ProGRP抗体（鼠单抗）固相酶标板--------------------------8孔×12

（2）POD标记抗体（冻干辣根过氧化物标记兔多抗）----------------5ml×3

（3）ProGRP标准品（冻干重组，1ng/安培，含稳定剂）----------1ml×2

（4）ProGRP标准品稀释液（含磷酸氢二钠．12H2O等）-------------20ml×1

（5）反应缓冲液（含磷酸氢二钾等）-------------------------20ml×1

（6）标记抗体溶解液（含磷酸氢二钾等）-------------------20ml×1

（7）浓缩洗涤液（含磷酸二氢钾等）-----------------100ml×1

（8）OPD片（含有邻苯二胺，10mg/片）------------------------4片

（9）底物溶解液（含有过氧化氢等，0.03-0.40mg/ml）---------------20ml×1

（10）反应终止液（2N-硫酸）--------------------------20ml×1

（11）微孔板密封胶片------------------------------------3

（12）镊子--------------------------------------------------1

操作方法

在使用本试剂盒之前，务请阅读有关“使用及保存的注意事项”。

1试剂配制方法

所有试剂在应用之前，都要平衡至20-30℃.

（1）POD标记抗体溶液的配制

将标记抗体溶解液5ml加入POD标记抗体的一个安培内，充分溶解即可。

已配制的POD标记抗体溶液可保存在2-8℃，于两周内使用。

（2）ProGRP标准液的配制

现将双蒸水1ml加入ProGRP标准品的一个安培内，充分溶解后，再用ProGRP标准品稀释液进行3倍系列稀释，以此作为ProGRP标准液。

用双蒸水1ml溶解后的ProGRP标准品，可在2-8℃保存，于一个月内使用。

（3）洗涤液的配制

用双蒸水将浓缩洗涤液稀释10倍，作为洗涤液。

洗涤液可放置于2-8℃保存，稳定一个月。

（4）OPD底物液的配制

用镊子将1片OPD溶于5ml底物溶解液中进行溶解，作为OPD底物液。

OPD底物液易产生气泡，因此在使用前要震荡混合，充分脱气后再使用。

OPD底物液要在用前10分钟进行配制，三个小时内使用。

（5）抗ProGRP抗体固相酶标板，ProGRP标准品稀释液，反应缓冲液，标记抗体溶解液，底物溶解液以及反应终止液，不需要任何配制即可使用。

2.标准操作方法

（1）从铝箔袋内取出所需数量的微孔板条，装至酶标板架上。

（2）首先设定一空白对照孔，然后向其他每个孔内加入100ul反应缓冲液。

（3）请按下图所示，向空白孔以外的各孔加入各50ulProGRP标准品稀释液，ProGRP标准液（在3倍系列稀释时，配制5个稀释度较好）或样品，全部加完后，将酶标板轻轻震荡，使内容物混合。

※下图是加ProGRP标准液之范例，标准品浓度分别为0#，12.3,37.0，111，333，1000pg/ml.（#:

0pg/ml标准液使用ProGRP标准品稀释液）

（4）用微孔板密封胶片将酶标板密封，置37℃，反应60分钟。

（5）反应完毕，将空内容物弃掉，在包括空白孔在内的各孔内加入洗涤液，330ut，然后再将洗涤液弃掉，如此重复操作5次。

（6）洗毕，向除空白孔以外的各孔内加入100utPOD标记抗体液。

（7）用微孔板密封胶片将酶标板密封，置20~30℃，反应30分钟。

（8）重复步骤（5）的洗涤过程。

（9）洗毕，向包括空白孔在内的各孔内加入100utOPD底物液。

（10）用微孔板密封胶片将酶标板密封，置20~30℃，避光反应30分钟。

（11）反应完毕，向包括空白孔在内的各孔内加入100ut反应终止液，轻轻震荡酶标板，使内容物混合均匀。

（12）反应终止1小时内，用酶标仪在490-495nm/600-700nm波长处，测定各孔吸光度值。

上述步骤是手工操作的，本试剂盒也可用全自动酶免分析仪来进行测定。

3.结果计算方法

（1）求出ProGRP标准液的吸光度平均值。

（2）以对数座标图的横轴为ProGRP标准品的浓度，以纵轴为ProGRP标准液的吸光度值，作出标准曲线（盒内附有座标图纸及标准曲线样图）。

（3）将测得的样品吸光度值在上述标准曲线上求出样品中ProGRP的浓度（也可用最小自乘法算出），对于超出标准曲线的样品，可将样品用ProGRP标准品稀释液稀释后测定。

性能及干扰因素

（1）灵敏度

1ProGRP标准品稀释液（0pg/ml）的吸光度值在0.1以下。

2ProGRP标准液（1000pg/ml）的吸光度值与ProGRP标准品稀释液（0pg/ml）的吸光度值之差为1.1~2.2.

（2）特异性

测定已知浓度的管理用血清时，其测定值是已知浓度的±15%以内。

（3）重复性

将同一样品同时进行5次测定时，其测定值的变异系数（CV值）为15%以下。

（4）测定范围

0~1000pg/ml。

（5）有关样品性质，采集方法以及干扰因素等的注意事项

1本试剂盒所用样品为血清

2不要进行针对样品中补体的加热处理，因可能会使样品中的ProGRP分解。

3有关样品的保存，请在采血后迅速进行血清分离，采血当日进行测定时，请在4℃保存，若于第二天以后进行测定时，请在-20℃一下冷冻保存。

4要避免样品的反复冻融

5样品中含有沉淀物（纤维蛋白，脂肪等）时，请采用离心分离等操作进行去除，呈透明后再使用。

6胆红素（嵌合型）21.7mg/dl，溶血血红蛋白470mg/dl，乳糜2450度，类风湿因子490U/ml时，对测定结果未见有影响。

7对于良性肾疾患患者

本试剂盒在测定小细胞肺癌患者血清时显示特异性高值（其测定均值为健康人的约100倍，良性肾疾患患者（非透析期肾功不全患者）重危时的血清（肌酐浓度1.6mg/dl以上），采用本试剂盒测定时，其测定值是正常人血清值得10倍左后高值。

使用及保存注意事项

（1）所有试剂均保存在2~8℃，并在标签上注明的效期内使用。

（2）所有试剂使用前平衡至20~30℃.

（3）试剂及反应液，在保存中或反应中均应避免日光直射。

（4）试剂在保存中要注意避免污染，若出现浑浊等异常时，请不要使用。

（5）本试剂盒是按批生产的，不同批号的试剂不要混用。

（6）进行OPD底物液配制时，要使用干净的，尤其是无金属污染的器具。

（7）要注意OPD片，OPD底物液以及反应终止液，不要粘附在皮肤及粘膜上，万一出现这种情况，要迅速用大量水来冲洗。

（8）OPD底物液配制及保存时，都要用避光容器，不要使用已明显变色的OPD底物液。

（9）注意反应终止液不要与金属器皿接触。

（10）为了避免产生孔与之间的反应时间差，特别是进行酶，底物液以及反应终止液的操作时，请迅速进行，并按照同一顺序，同一间隔操作。

（11）每个样品的测定值均由标准曲线求出。

（12）样品要按传染源保存。

（13）不要弄脏孔的外底面。

（14）在洗板时，最有一次洗净时不要残存洗涤液。

（15）血清存在病菌传染的危险性，所有废液以及一次性器具，都要考虑具有传染的危险性，请按下述某种方法进行处理。

1高温灭菌。

在121℃进行1小时以上的高压蒸汽灭菌，但是，含有次氨酸钠的废液不要采用高压灭菌。

2次氨酸钠溶液浸泡（有效氯1000ppm以上）1小时以上，含有酸的废液要中和以后再进行处理。

贮存

2~8℃（暗处）

小细胞肺癌标记物——ProGRP酶免测定试剂盒使用说明

前言

ProGRP是促胃泌素释放肽前体，是由日本国立癌中心发现的小细胞肺癌标志物，通过测定患者血中ProGRP的浓度，可以较早期发现X线或其他方法不能发现的小细胞肺癌。

ProGRP单克隆抗体，因此具有高灵敏度和高特异性，是理想的小细胞肺癌早期诊断的实验室检查方法。

测定原理

本试剂盒采用酶标板固相EIA夹心法原理，首先在酶标板内预包被抗ProGRP单抗，从而与样品中的ProGRP结合形成抗原——抗体复合物；然后加入POD标记抗体，与上述复合物结合；再加入底物液进行显色，最后依据显色程度确定样品中ProGRP的浓度。

试剂盒组成

（1）抗ProGRP单抗预包被酶标板----------------------8孔×12

（2）POD标记抗体（冻干品）--------------------------5ml×3

（3）ProGRP标准品（冻干品，1ng/安培）----------1ml×2

（4）ProGRP标准品稀释液------------------------------20ml×1

（5）反应缓冲液-------------------------------------------20ml×1

（6）标记抗体溶解液-------------------------------------20ml×1

（7）浓缩洗涤液------------------------------------------100ml×1

（8）OPD片-----------------------------------------------4片

（9）底物溶解液------------------------------------------20ml×1

（10）反应终止液-----------------------------------------20ml×1

（11）微孔板密封胶片-----------------------------------3

（12）镊子-------------------------------------------------1

操作方法

1.试剂配制方法

所有试剂在应用之前，都要平衡至20-30℃.

（1）POD标记抗体溶液的配制：

将标记抗体溶解液5ml加入POD标记抗体的一个安培中，充分溶解即可。

（已配制的POD标记抗体溶液可保存在2-8℃，与两周内使用）。

（2）ProGRP标准液的配制：

先将双蒸水1ml加入ProGRP标准品的一个安培内，充分溶解后，再用ProGRP标准品稀释液进行3倍系列稀释，以此作为ProGRP标准液（用双蒸水1ml溶解后的ProGRP标准品，可在2-8℃保存，于一个月内使用）。

（3）洗涤液的配制：

用双蒸水将浓缩洗涤液稀释10倍，作为洗涤液（洗涤液可放置于2-8℃保存，稳定一个月）。

（4）OPD底物液的配制：

用镊子将1片OPD溶于5ml底物溶解液中，作为OPD底物液，OPD底物液易产生气泡因此在使用前要震荡混合，充分脱气后再使用；OPD底物液要在用前10分钟进行配制，三小时内使用）。

2.标准操作方法

（1）从铝箔袋内去除所需数量的微孔板条，装至酶标板架上

（2）首先设定一空白对照孔，然后向其他每个孔内加入100ul反应缓冲液。

（3）请按下图所示，向空白孔以外的各孔加入各50ulProGRP标准品稀释液，ProGRP标准液（在3倍系列稀释时，，配制5个稀释度较好）或样品，全部加完后，将酶标板轻轻震荡，使内容物混合。

※下图是加ProGRP标准液之范例，标准品浓度分别为0，12.3，37.0，111，333，100pg/ml。

（3#：

opg/ml标准液使用ProGRP标准品稀释液）。

（4）用微孔板密封胶片将酶标板密封，置37℃，反应60分钟。

（5）将空内液体弃掉，每孔（含空白孔）加入洗涤液300ut；然后将洗涤液弃掉，共洗5次。

（6）每孔（空白孔除外）加入100utPOD标记抗体溶液。

（7）用微孔板密封胶片将酶标板密封，置20~30℃，避光反应30分钟。

（8）重复步骤（5）的洗涤过程。

（9）每孔（含空白孔）加入100utOPD底物液。

（10）用微孔板密封胶片将酶标板密封，置20~30℃，避光反应30分钟。

（11）每孔加入100ut反应终止液，轻轻震荡酶标板，是内容物混合均匀。

（12）终止后1小时内，用酶标仪在490-495nm/700nm波长处，测定各孔吸光度值。

3.结果计算方法

（1）求出ProGRP标准液的吸光度平均值。

（2）以对数座标图的横轴为ProGRP标准品的浓度，以纵轴为ProGRP标准液的吸光度值，作出标准曲线（盒内附有座标图纸及标准曲线样图）。

（3）将测得的样品吸光度值在上述标准曲线上求出样品中ProGRP的浓度，对于超出标准曲线的样品，可将样品用ProGRP标准稀释液稀释后测定。

（4）结果判定法

本试剂盒测定的正常值范围是6.5~31.0pg/ml。

一般以正常人9%上限值（平均值＋3×标准差）46pg/ml作为适宜的临界值。

如测定值比临界值高时，还要结合图像诊断和活检等，最终作出小细胞肺癌的确切诊断。

注意事项：

请仔细阅读所附材料中之详细说明。

贮存：

2~8℃（暗处）

有效期限：

12个月（见包装盒）

包装：

96人份（8孔×12）