1、小细胞肺癌标记物小细胞肺癌标记物proGRP酶免测定试剂盒使用说明前言 促胃泌素释放肽(gastrin releasing peptide;GRP)是1978年由McDonald等从猪的胃组织中分离出来的,具有促胃泌素分泌促进作用。由27个氨基酸组成的脑肠肽。人的GRP遗传子是在1984年克隆成功的。由于细胞产生三种不同的GRP mRNA,从而合成C末端不同结构的三种GRP前体(proGRP)。但其活性结构均相同。 肺癌与GRP的关系,是1978年在人胚胎肺内分泌细胞中发现存在bombesin免疫活性后开始认识到的。1983年,日本国立癌中心的山口等自该内分泌细胞的发生分化着手,认为小细胞肺癌
2、癌细胞可能分泌GRP,其后证明,GRP是小细胞肺癌的重要产物。即而又证明了血中GRP试小细胞肺癌的重要标志物。同时证明,使用ProGRP作为抗原,利用RIA法分析血中ProGRP,亦可作为临床用小细胞肺癌的肿瘤标志物。本试剂盒是以国立癌中心为主,由东燃株式会社和TERUMO株式会社共同开发的酶免测定法试剂盒。本试剂盒采用了三种ProGRP的结构相同部分之单克隆抗体,因此具有高灵敏度,尤其在小细胞肺癌时显示出较高的值,从而可区别肺部其他肿瘤和各种良性疾患,因此是特异性极高的试剂盒。 终上所述,本试剂盒可以检测出用X线或其他方法不能发现的早期小细胞肺癌,因此可作为小细胞肺癌早期诊断的辅助手段。特点
3、(1) 高亲和性单克隆抗体的使用使本试剂盒具有高灵敏度和高特异性。(2) 因采用固相酶标板,所以适用于大量样品的处理。(3) 操作简单。测定原理本试剂盒采用酶标板固相EIA夹心法原理(1) 一次反应酶标板内预包被抗ProGRP单抗与样品中的ProGRP结合形成抗原抗体复合物。(2) 二次反应将未反应物洗涤去除后,加入POD标记抗体,与上述复合物结合。(3) 显色反应将未反应物洗涤去除后,加入OPD(邻苯二胺)底物液进行显色。(4) 测定在490-495nm波长段)或490-495600-700nm)进行吸光度测定,使用试剂盒提供的ProGRP标准品作出标准曲线,再求出被测样品中的ProGRP浓
4、度。(5) 判定结果将上述求出的ProGRP浓度与临界值进行比较,其结果即可作为诊断小细胞肺癌的辅助。试剂盒组成本产品由下述试剂所组成(1) 抗ProGRP抗体(鼠单抗)固相酶标板-8孔12(2) POD标记抗体(冻干辣根过氧化物标记兔多抗)-5ml3(3) ProGRP标准品(冻干重组,1ng/安培,含稳定剂)-1ml2(4) ProGRP标准品稀释液(含磷酸氢二钠12H2O等)-20ml1(5) 反应缓冲液(含磷酸氢二钾等)-20ml1(6) 标记抗体溶解液(含磷酸氢二钾等)-20ml1(7) 浓缩洗涤液(含磷酸二氢钾等)-100ml1(8) OPD片(含有邻苯二胺,10mg/片)-4片(
5、9) 底物溶解液(含有过氧化氢等,0.03-0.40mg/ml)-20ml1(10) 反应终止液(2N-硫酸)-20ml1(11) 微孔板密封胶片-3(12) 镊子-1操作方法 在使用本试剂盒之前,务请阅读有关“使用及保存的注意事项”。1试剂配制方法 所有试剂在应用之前,都要平衡至20-30.(1) POD标记抗体溶液的配制将标记抗体溶解液5ml加入POD标记抗体的一个安培内,充分溶解即可。已配制的POD标记抗体溶液可保存在2-8,于两周内使用。(2) ProGRP标准液的配制现将双蒸水1ml加入ProGRP标准品的一个安培内,充分溶解后,再用ProGRP标准品稀释液进行3倍系列稀释,以此作为
6、ProGRP标准液。用双蒸水1ml溶解后的ProGRP标准品,可在2-8保存,于一个月内使用。(3) 洗涤液的配制用双蒸水将浓缩洗涤液稀释10倍,作为洗涤液。洗涤液可放置于2-8保存,稳定一个月。(4) OPD底物液的配制用镊子将1片OPD溶于5ml底物溶解液中进行溶解,作为OPD底物液。OPD底物液易产生气泡,因此在使用前要震荡混合,充分脱气后再使用。OPD底物液要在用前10分钟进行配制,三个小时内使用。(5) 抗ProGRP抗体固相酶标板,ProGRP标准品稀释液,反应缓冲液,标记抗体溶解液,底物溶解液以及反应终止液,不需要任何配制即可使用。 2.标准操作方法 (1)从铝箔袋内取出所需数量
7、的微孔板条,装至酶标板架上。 (2)首先设定一空白对照孔,然后向其他每个孔内加入100ul反应缓冲液。 (3)请按下图所示,向空白孔以外的各孔加入各50ul ProGRP标准品稀释液,ProGRP标准液(在3倍系列稀释时,配制5个稀释度较好)或样品,全部加完后,将酶标板轻轻震荡,使内容物混合。 下图是加ProGRP标准液之范例,标准品浓度分别为0#,12.3, 37.0, 111, 333, 1000pg/ml.(#:0pg/ml标准液使用ProGRP标准品稀释液) (4)用微孔板密封胶片将酶标板密封,置37,反应60分钟。 (5)反应完毕,将空内容物弃掉,在包括空白孔在内的各孔内加入洗涤液,
8、330ut,然后再将洗涤液弃掉,如此重复操作5次。 (6)洗毕,向除空白孔以外的各孔内加入100ut POD标记抗体液。 (7)用微孔板密封胶片将酶标板密封,置2030,反应30分钟。 (8)重复步骤(5)的洗涤过程。 (9)洗毕,向包括空白孔在内的各孔内加入100ut OPD底物液。 (10)用微孔板密封胶片将酶标板密封,置2030,避光反应30分钟。 (11)反应完毕,向包括空白孔在内的各孔内加入100ut反应终止液,轻轻震荡酶标板,使内容物混合均匀。 (12)反应终止1小时内,用酶标仪在490-495nm/600-700nm波长处,测定各孔吸光度值。 上述步骤是手工操作的,本试剂盒也可用
9、全自动酶免分析仪来进行测定。3.结果计算方法(1)求出ProGRP标准液的吸光度平均值。(2)以对数座标图的横轴为ProGRP标准品的浓度,以纵轴为ProGRP标准液的吸光度值,作出标准曲线(盒内附有座标图纸及标准曲线样图)。(3)将测得的样品吸光度值在上述标准曲线上求出样品中ProGRP的浓度(也可用最小自乘法算出),对于超出标准曲线的样品,可将样品用ProGRP标准品稀释液稀释后测定。性能及干扰因素(1) 灵敏度1 ProGRP标准品稀释液(0pg/ml)的吸光度值在0.1以下。2 ProGRP标准液(1000pg/ml)的吸光度值与ProGRP标准品稀释液(0pg/ml)的吸光度值之差为
10、1.12.2.(2) 特异性测定已知浓度的管理用血清时,其测定值是已知浓度的15%以内。(3) 重复性将同一样品同时进行5次测定时,其测定值的变异系数(CV值)为15%以下。(4) 测定范围01000pg/ml。(5) 有关样品性质,采集方法以及干扰因素等的注意事项1 本试剂盒所用样品为血清2 不要进行针对样品中补体的加热处理,因可能会使样品中的ProGRP分解。3 有关样品的保存,请在采血后迅速进行血清分离,采血当日进行测定时,请在4保存,若于第二天以后进行测定时,请在-20一下冷冻保存。4 要避免样品的反复冻融5 样品中含有沉淀物(纤维蛋白,脂肪等)时,请采用离心分离等操作进行去除,呈透明
11、后再使用。6 胆红素(嵌合型)21.7mg/dl,溶血血红蛋白 470mg/dl,乳糜2450度,类风湿因子490U/ml时,对测定结果未见有影响。7 对于良性肾疾患患者本试剂盒在测定小细胞肺癌患者血清时显示特异性高值(其测定均值为健康人的约100倍,良性肾疾患患者(非透析期肾功不全患者)重危时的血清(肌酐浓度1.6mg/dl以上),采用本试剂盒测定时,其测定值是正常人血清值得10倍左后高值。使用及保存注意事项(1) 所有试剂均保存在28,并在标签上注明的效期内使用。(2) 所有试剂使用前平衡至2030.(3) 试剂及反应液,在保存中或反应中均应避免日光直射。(4) 试剂在保存中要注意避免污染
12、,若出现浑浊等异常时,请不要使用。(5) 本试剂盒是按批生产的,不同批号的试剂不要混用。(6) 进行OPD底物液配制时,要使用干净的,尤其是无金属污染的器具。(7) 要注意OPD片,OPD底物液以及反应终止液,不要粘附在皮肤及粘膜上,万一出现这种情况,要迅速用大量水来冲洗。(8) OPD底物液配制及保存时,都要用避光容器,不要使用已明显变色的OPD底物液。(9) 注意反应终止液不要与金属器皿接触。(10) 为了避免产生孔与之间的反应时间差,特别是进行酶,底物液以及反应终止液的操作时,请迅速进行,并按照同一顺序,同一间隔操作。(11) 每个样品的测定值均由标准曲线求出。(12) 样品要按传染源保
13、存。(13) 不要弄脏孔的外底面。(14) 在洗板时,最有一次洗净时不要残存洗涤液。(15) 血清存在病菌传染的危险性,所有废液以及一次性器具,都要考虑具有传染的危险性,请按下述某种方法进行处理。1 高温灭菌。在121进行1小时以上的高压蒸汽灭菌,但是,含有次氨酸钠的废液不要采用高压灭菌。2 次氨酸钠溶液浸泡(有效氯1000ppm以上)1小时以上,含有酸的废液要中和以后再进行处理。贮存28(暗处)小细胞肺癌标记物ProGRP酶免测定试剂盒使用说明前言ProGRP是促胃泌素释放肽前体,是由日本国立癌中心发现的小细胞肺癌标志物,通过测定患者血中ProGRP的浓度,可以较早期发现X线或其他方法不能发
14、现的小细胞肺癌。ProGRP单克隆抗体,因此具有高灵敏度和高特异性,是理想的小细胞肺癌早期诊断的实验室检查方法。测定原理本试剂盒采用酶标板固相EIA夹心法原理,首先在酶标板内预包被抗ProGRP单抗,从而与样品中的ProGRP结合形成抗原抗体复合物;然后加入POD标记抗体,与上述复合物结合;再加入底物液进行显色,最后依据显色程度确定样品中ProGRP的浓度。试剂盒组成(1) 抗ProGRP单抗预包被酶标板-8孔12(2) POD标记抗体(冻干品)-5ml3(3) ProGRP标准品(冻干品,1ng/安培)-1ml2(4) ProGRP标准品稀释液-20ml1(5) 反应缓冲液-20ml1(6)
15、 标记抗体溶解液-20ml1(7) 浓缩洗涤液-100ml1(8) OPD片-4片(9) 底物溶解液-20ml1(10) 反应终止液-20ml1(11) 微孔板密封胶片-3(12) 镊子-1操作方法1. 试剂配制方法所有试剂在应用之前,都要平衡至20-30.(1) POD标记抗体溶液的配制:将标记抗体溶解液5ml加入POD标记抗体的一个安培中,充分溶解即可。(已配制的POD标记抗体溶液可保存在2-8,与两周内使用)。(2) ProGRP标准液的配制:先将双蒸水1ml加入ProGRP标准品的一个安培内,充分溶解后,再用ProGRP标准品稀释液进行3倍系列稀释,以此作为ProGRP标准液(用双蒸水
16、1ml溶解后的ProGRP标准品,可在2-8保存,于一个月内使用)。(3) 洗涤液的配制:用双蒸水将浓缩洗涤液稀释10倍,作为洗涤液(洗涤液可放置于2-8保存,稳定一个月)。(4) OPD底物液的配制:用镊子将1片OPD溶于5ml底物溶解液中,作为OPD底物液,OPD底物液易产生气泡因此在使用前要震荡混合,充分脱气后再使用;OPD底物液要在用前10分钟进行配制,三小时内使用)。2. 标准操作方法(1) 从铝箔袋内去除所需数量的微孔板条,装至酶标板架上(2) 首先设定一空白对照孔,然后向其他每个孔内加入100ul反应缓冲液。(3) 请按下图所示,向空白孔以外的各孔加入各50ul ProGRP标准
17、品稀释液,ProGRP标准液(在3倍系列稀释时,配制5个稀释度较好)或样品,全部加完后,将酶标板轻轻震荡,使内容物混合。下图是加ProGRP标准液之范例,标准品浓度分别为0, 12.3, 37.0, 111, 333, 100pg/ml。(3#:opg/ml标准液使用ProGRP标准品稀释液)。 (4) 用微孔板密封胶片将酶标板密封,置37,反应60分钟。(5) 将空内液体弃掉,每孔(含空白孔)加入洗涤液300ut;然后将洗涤液弃掉,共洗5次。(6) 每孔(空白孔除外)加入100utPOD标记抗体溶液。(7) 用微孔板密封胶片将酶标板密封,置2030,避光反应30分钟。(8) 重复步骤(5)的
18、洗涤过程。(9) 每孔(含空白孔)加入100utOPD底物液。(10) 用微孔板密封胶片将酶标板密封,置2030,避光反应30分钟。(11) 每孔加入100ut反应终止液,轻轻震荡酶标板,是内容物混合均匀。(12) 终止后1小时内,用酶标仪在490-495nm/700nm波长处,测定各孔吸光度值。3. 结果计算方法(1) 求出ProGRP标准液的吸光度平均值。(2) 以对数座标图的横轴为ProGRP标准品的浓度,以纵轴为ProGRP标准液的吸光度值,作出标准曲线(盒内附有座标图纸及标准曲线样图)。(3) 将测得的样品吸光度值在上述标准曲线上求出样品中ProGRP的浓度,对于超出标准曲线的样品,可将样品用ProGRP标准稀释液稀释后测定。(4) 结果判定法本试剂盒测定的正常值范围是6.531.0pg/ml。一般以正常人9%上限值(平均值3标准差) 46pg/ml 作为适宜的临界值。如测定值比临界值高时,还要结合图像诊断和活检等,最终作出小细胞肺癌的确切诊断。注意事项:请仔细阅读所附材料中之详细说明。贮存:28(暗处)有效期限:12个月(见包装盒)包装:96人份(8孔12)
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