《分子生物学》实验指导.docx

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《分子生物学》实验指导

《分子生物学》实验指导

实验1总DNA提取

生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。

由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。

同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。

本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。

[实验目的]

学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。

学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。

[实验原理]

植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。

本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。

CTAB是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。

植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。

CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。

经过氯仿/异戊醇（24:

1）抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。

核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。

纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/mlDNA溶液A260=0.020。

[实验器材]

1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料

[实验试剂]

1、3×CTABbuffer（pH8.0）

100mMTris

25mMEDTA

1.5MNaCl

3%CTAB

2%β-巯基乙醇

2、TE缓冲液（pH8.0）

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA

3、氯仿-异戊醇混合液（24：

1，V/V）

4、95％乙醇

5、液氮

[实验步骤]

1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。

2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。

3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65℃水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。

4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。

5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4℃下8000rpm离心10min。

6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。

（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。

）

7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。

沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95％乙醇。

边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。

8、小心取下这些纤维状沉淀，加1～2mL70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。

9、将粗制品溶于TE缓冲液。

10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。

[注意事项]

1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。

2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。

[思考题]

CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？

液氮研磨的原理是什么？

实验二质粒DNA的提取

质粒DNA是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。

质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质，是环状的双链DNA分子。

由于质粒比较小，并且能进行独立的自我复制，常常被改造为克隆和表达的载体分子。

[实验目的]

通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的基本原理，掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。

[实验原理]

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

[实验器材]

1、恒温培养箱

2、恒温摇床

3、台式离心机

4、高压灭菌锅

5、Tip头、Eppendorg管

6、含有目的质粒的E.coli菌株

[实验试剂]

1、溶液I

50mmol/L葡萄糖

5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl

10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

2、溶液II

0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合

3、溶液III

5mol/L乙酸钾60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

4、TE缓冲液

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA（pH8.0）

5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

6、EcoRI及其缓冲液

7、HindIII及其缓冲液

[实验步骤]

1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。

3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

5、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。

6、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。

7、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

8、向上清液加入等体积的饱和酚，混匀。

9、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

10、向上清液加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。

12000r/min离心5min。

倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

11、1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。

12、20μLTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

[注意事项]

操作时，避免剧烈震荡。

[思考题]

1、实验操作中，饱和酚的作用是什么？

2、SDS和NaOH的作用是什么？

[参考文献]

《精编分子生物学实验指南》（第四版）

[美]FM奥斯伯，RE金斯顿等主编科学出版社2005

实验三总RNA提取

【目的和要求】

1．掌握样品中总RNA的提取的原理和方法。

2．熟悉RNA纯度及浓度检测方法。

3．了解RNA提取过程中的注意事项。

【实验原理】

RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。

对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。

获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。

由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。

再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。

在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。

因此提取必须在无RNase的环境中进行。

可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。

提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性，并有助于除去非核酸成分。

【教学内容】

1．总RNA提取的基本原理和常用方法介绍

2．进行动物组织或血液样品总RNA提取。

3．对提取的RNA的进行纯度和浓度检测。

【实验器材和试剂】

超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管。

玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1%DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。

细胞裂解液：

异硫氰酸胍4mol/L；柠檬酸钠（pH7.0）25mmol/L；十二烷基肌氨酸钠0.5%；β-巯基乙醇0.1mol/L（称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。

然后取以上配制的溶液（CBS液）33ml，异硫氰酸胍25g,混合，完全溶解后4℃保存备用）

TRIzolRNA抽提试剂、2mol醋酸钠、0.1%DEPC、平衡酚：

氯仿：

异戊醇（25：

24：

1）、氯仿、无水乙醇、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水。

【实验方法】

（一）异硫氰酸胍法（PLT）

1．取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。

然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

2．加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。

3．加入1.2ml酚：

氯仿：

异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。

4．将混合物转移至1.5mlEp管中，4℃，离心10000r/min,20min.

5．移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置-20℃，30min沉淀RNA.

6．4℃，离心12000r/min，15min.

7．弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10000r/min，10min。

8．弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。

9．加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），-70℃保存。

（二）TrizolReagent/总RNA提取试剂

TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。

加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。

取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。

下面介绍由上海美季生物技术有限公司总RNA提取试剂推荐的操作步骤：

1.匀浆处理（Homogenization）

（1）组织中提取总RNA

①植物组织：

植物叶片直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物叶片加入1mlTRIzol。

②动物组织：

按10-30mg组织加入1mlTRIzol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆。

（2）培养细胞中提取总RNA

①贴壁细胞：

无须胰酶消化，可直接用TRIzol进行裂解，每10平方厘米培养面积加1mlTRIzol。

②悬浮细胞：

可直接离心收集、裂解，每1mlTRIzol可裂解5×106动物或酵母细胞，或107细菌细胞。

（3）血液中提取总RNA

直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。

彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。

每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mlTRIzol。

2．分层（PhaseSeparation）

（1）样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。

注：

如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。

可选步骤：

4℃12,000rpm离心10分钟，取上清。

如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。

处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。

取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

（2）每1mlTRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。

3．RNA沉淀（RNAPrecipitation）

（1）4℃12,000rpm离心10-15min。

样品会分成三层：

黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（通常可吸取550μl）转移到新管中。

注：

小心吸取水相，千万不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA污染。

（2）在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。

4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。

4．RNA漂洗（RNAWash）

（1）RNA沉淀中加入1ml75%乙醇（用RNase-free水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀。

每1mlTRIzol加入1ml75％乙醇。

（2）4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。

室温放置1-2分钟晾干沉淀。

注：

RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

5.溶解RNA（RedissolvingtheRNA）

沉淀中加入50-100μlRNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。

（三）RNA纯度及浓度检测

1．完整性RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：

1.2%胶；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15分钟）检测完整性。

由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。

动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18SrRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16SrRNA。

RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。

出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

2．纯度OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。

高质量的RNA样品，OD260/OD280值（10mMTris,pH7.5）在2.0左右。

OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。

同一个RNA样品，假定在10mMTris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

3．浓度取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：

终浓度（ng/μl）=OD260×n（稀释倍数）×40

【注意事项】

1．RNA是极易降解的核酸分子。

因此提取总RNA必须在无RNase环境中，戴口罩、手套、使用无RNase污染的试剂、材料、容器。

2．所有溶液应加DEPC至0.05%～0.1%，室温处理过夜，然后高压处理或加热至70℃1小时或60℃过夜，以除去石油残留的DEPC。

3．所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺，所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA酶活性。

4．操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套、，实验过程中手套要勤换。

实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA

琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是D-半乳糖-3,6-L半乳糖。

许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。

该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。

在pH4.0-9.0的缓冲液中稳定。

由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于0.05时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。

在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如DNA分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。

[实验目的]

学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术和原理，以及溴化乙锭染色检测核酸的实验技术。

[实验原理]

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：

超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA），开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂（opencircularDNA,简称OCDNA），线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linearDNA,简称LDNA）。

这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。

因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

溴化乙锭可以嵌入核酸分子，并且在紫外灯下产生荧光，可用于检测核酸物质。

[实验器材]

1、琼脂糖凝胶电泳系统

2、凝胶成像系统

3、DNAmarker

4、检测样品

5、琼脂糖

[实验试剂]

1、5×TBE（5倍体积的TBE贮存液）

配1000ml5×TBE：

Tris54g

硼酸27.5g

0.5mol/lEDTA20ml（pH8.0）

2、凝胶加样缓冲液（6×）

溴酚蓝0.25%

蔗糖40%

3、溴化乙锭溶液（EB）0.5μg/ml

[实验步骤]

（一）制备琼脂糖凝胶

1、按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。

可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度/%线性DNA的有效分离范围/kb

0.35-60

0.61-20

0.70.8-10

0.90.5-7

1.20.4-6

1.50.2-4

2.00.1-3

2、称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。

（二）胶板的制备

1、取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。

2、有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

3、将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

4、待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。

5、加入电泳缓冲液至电泳槽中，让缓冲液盖过凝胶。

（三）加样

用移液枪将将上样缓冲液与DNA样品按1:

5比例混合，加入加样孔中（记录点样顺序及点样量）。

（四）电泳

1、接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。

DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。

2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。

3、将凝胶小心放入溴化乙锭溶液中，染色30min。

4、将染色后的凝胶放入凝胶成像仪中拍照。

[注意事项]

因为EB是强致癌物质，因此染色操作中应注意安全不要接触，并且保持环境的洁净。

[参考文献]

《精编分子生物学实验指南》（第四版）

[美]FM奥斯伯，RE金斯顿等主编科学出版社2005

实验五PCR扩增制备目的基因

PCR技术是在1985年由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明的聚合酶链反应。

这一技术具有划时代意义的。

其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

[实验目的]

学习和掌握PCR反应的基本原理与实验技术。

[实验原理]

多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。

在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

1、变性：

加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2、退火：

使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。

3、延伸：

溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5′→3′方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：

DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。

[实验器材]

1、PCR热循环仪2、tip头、冰盒3、PCR管4、超纯水5、DNA相对分子质量标准物

6、移液枪

[实验试剂]

1、10×缓冲液

500mmol/lKCl

100mmol/lTris·HCl（pH8.3,室温）

15mmol/lMgCl2

0.1%明胶

2、4×dNTP

1mmol/ldATP

1mmol/ldCTP

1mmol/ldGTP

1mmol/ldTTP

3、Taq酶5U/μL

4、DNA模板1ng/μL

5、引物1、引物2

引物溶液浓度10pmol/μl

[实验步骤]

1、在PCR管内配制20μL反应体系：

反应物体积/μL

10×buffer2.0

dNTP1.0

引物11.0

引物21.0

Taq酶0.5

Template1

ddH2O13.5

总体积20

2、按下列程序进行扩增：

①、95℃预变性5min

②、95℃变性1min

③、55℃退火1min

④、72℃延伸1min

⑤、重复步骤②~④30次；

⑥、72℃延伸10min

3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

配制0.7%琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。

保持电流40mA。

电泳结束后，紫外灯下观察结果。

[注意事项]

1、PCR加样时，尽量保持低温操作，避免酶失活和模板、引物降解。

2、取样时注意不要污染药品。

[思考题]

1、什么是引物二聚体？

出现引物二聚体的原因是什么？

2、PCR仪的热盖设置有什么优点？

[参考文献]

1、《PCR技术操作和应用指南》主编林万明人民军医出版社1995年

2、《PCR技术实验指南》[美]C