生物药物综合实验----植物原生质体的制备.ppt

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北京电子科技学院北京电子科技学院-生物系生物系生物药物综合实验王维彬实验实验八八植物原生质体的制备植物原生质体的制备实验目的实验目的实验原理实验原理实验器材实验器材实验方法实验方法实验结果实验结果注意事项注意事项思考题思考题学学习习用用酶酶溶溶解解细细胞胞壁壁的的方方法法制制备备原原生生质质体体，为为细细胞胞生理研究提供必要基础。

生理研究提供必要基础。

掌握植物原生质体分离的基本原理及其操作过程掌握植物原生质体分离的基本原理及其操作过程实验目的实验目的植植物物原原生生质质体体是是指指包包在在植植物物细细胞胞壁壁内内的的生生活活物物质质，可可通通过过混混合合酶酶液液消消化化细细胞胞壁壁而而获获得得。

原原生生质质体体经经适适宜宜的的培培养养能能合合成成新新壁壁，并并进进行行细细胞胞分分裂裂，经经特特殊殊诱诱导导可可生生成成完完整整植植株株。

除除去去细细胞胞壁壁后后为为原原生生质质所所包包围围的的“裸裸露露细细胞胞”，是是开开展展基基础础研研究究的的理理想想材材料料。

其其中中酶酶解解法法分分离离原原生生质质体体是是一一个个常常用用的的技技术术，其其原原理理是是植植物物细细胞胞壁壁主主要要由由纤纤维维素素、半半纤纤维维素素和和果果胶胶质质组组成成，因因而而使使用用纤纤维维素素酶酶、半半纤纤维维素素酶酶和和果果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

实验原理实验原理材料：

材料：

油菜或菠菜或烟草叶片试剂：

试剂：

（1）酶混合液l1纤维素酶l1果胶酶l0.7mol/L甘露醇l0.7mmol/LKH2PO4l10mmol/LCaCl22H2OlpH6.87.0实验器材实验器材l

（2）12%甘露醇l（3）0.16mol/LCaCl2l（4）20%蔗糖液仪器：

仪器：

离心机、显微镜等l1.材料称取与质壁分离材料称取与质壁分离l称取称取0.5g0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块，蒸馏水材料，撕去叶下表皮，先切成大块，蒸馏水冲洗冲洗4-54-5次。

加入次。

加入12%12%甘露醇，质壁分离甘露醇，质壁分离0.5h0.5h，滤去甘露醇，滤去甘露醇，将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中，吸干叶片表将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中，吸干叶片表面水分，将材料切成面水分，将材料切成0.5cm20.5cm2小块备用小块备用实验方法实验方法2.酶解酶解l将切碎的材料放入到培养皿中，取酶混合液将切碎的材料放入到培养皿中，取酶混合液5ml5ml到到培养皿中，让去除下表皮的一面接触酶液。

黑暗下酶培养皿中，让去除下表皮的一面接触酶液。

黑暗下酶解解1.51.5小时，中间轻晃几次。

小时，中间轻晃几次。

3.原生质体的收集与纯化原生质体的收集与纯化（11）将酶）将酶-原生质体混合液收集于原生质体混合液收集于10mL10mL刻度离心管中，刻度离心管中，盖盖，盖盖，600800r/min600800r/min离心离心7min7min，使原生质体沉降。

，使原生质体沉降。

（22）去上清液，留沉淀即收集的原生质体。

向离心管中）去上清液，留沉淀即收集的原生质体。

向离心管中缓缓加入缓缓加入0.16mol/L0.16mol/L氯化钙液约氯化钙液约2mL2mL，轻轻吹打均匀，轻轻吹打均匀，使沉淀悬浮。

使沉淀悬浮。

（33）用注射器向离心管底部缓缓注入）用注射器向离心管底部缓缓注入20%20%蔗糖液约蔗糖液约223mL3mL，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液。

，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液。

（44）以）以600rpm600rpm离心离心1010分钟，在两液相之间出现一条绿色分钟，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体。

带，便是纯净的原生质体。

44、原生质体的观察、原生质体的观察l用吸管取一滴纯化好的原生质体放在载玻片上，用吸管取一滴纯化好的原生质体放在载玻片上，用吸水纸将多余液体吸干，置显微镜下进行观察。

用吸水纸将多余液体吸干，置显微镜下进行观察。

实验结果实验结果11、从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。

但在实际操作中，只有用去除细胞壁而得到原生质体。

但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。

所以，为了制备健康幼嫩的组织才能完成去壁的过程。

所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不能被酶降解。

因此，取材成为实验成功与否外壁，则不能被酶降解。

因此，取材成为实验成功与否的首要问题。

的首要问题。

22、在离心过程中一定要注意转速。

在离心过程中一定要注意转速。

注意事项l11、简述植物原生质体制备的方法步骤；、简述植物原生质体制备的方法步骤；22、按镜下观察绘制原生质体。

、按镜下观察绘制原生质体。

l思考题名