专题一 微生物的培养与应用 讲义.docx

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专题一微生物的培养与应用讲义

专题一　微生物的培养与应用　　

1.微生物的分离和培养（Ⅱ）。

2.某种微生物数量的测定（Ⅰ）。

3.培养基对微生物的选择作用（Ⅱ）。

4.利用微生物发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用（Ⅱ）。

专题知识检测　　　　　　　　　　　　　　　　　　

1．培养基

（1）培养基一般含有水、碳源、氮源和无机盐。

（2）培养基按物理状态分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；按功能分为选择培养基和鉴别培养基。

2．常见的两种接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。

3．三种常用的灭菌方法

（1）灼烧灭菌，如接种环、接种针。

（2）干热灭菌，如玻璃器皿和金属用具等。

（3）高压蒸汽灭菌，如培养基等。

4．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数过程

土壤取样→样品稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上→筛选能生长的微生物菌落。

5．分解纤维素的微生物分离的实验原理

6．微生物计数的“2”种方法

（1）直接计数法：

需用血细胞计数板借助显微镜观察，实验结果偏大。

（2）间接计数法：

稀释涂布平板法，计数结果偏小。

7．菌种的保存方法

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保存的方法。

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

核心考点突破

考点　微生物的培养、分离与计数

1．消毒和灭菌的比较

2．平板划线法每次灼烧的目的

3．纯化微生物的接种方法

4．选择培养基与鉴别培养基的比较

题型一　微生物的实验室培养及无菌操作技术

1．在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。

请回答下列相关问题：

（1）培养基能为培养的微生物提供营养。

各种培养基的具体配方不同，但一般都含有________________、________________、________________、________________；另外，培养基还需要满足微生物生长对________________、________________、________________的要求。

（2）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。

对实验操作的空间、操作者的衣着和手，需进行清洁和________（填“消毒”和“灭菌”）；对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等需进行________（填“消毒”和“灭菌”）。

（3）微生物接种的方法很多，其核心都是要防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。

微生物接种最常用的方法是____________和____________。

（4）对分离的微生物作进一步的鉴定，常需要借助生物化学的方法。

如在以______________为唯一氮源的培养基中加入______________，可用来鉴定分解尿素的细菌；在以______________为唯一碳源的培养基中加入______________，可用来鉴定纤维素分解菌。

答案　

（1）水　碳源　氮源　无机盐　pH　特殊营养物质　氧气

（2）消毒　灭菌　（3）平板划线法　稀释涂布平板法

（4）尿素　酚红指示剂　纤维素　刚果红

解析　

（1）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。

（2）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，对实验操作的空间、操作者的衣着和手，需进行清洁和消毒，对用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等需进行灭菌。

（3）常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。

（4）微生物的鉴定常用鉴别培养基，在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，观察是否变红，可用来鉴定分解尿素的细菌；在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，观察是否有透明圈产生，可用来鉴定纤维素分解菌。

2．2016年7月郑州市卫生计生委发布的第3期卫生监测信息显示有15家美容美发场所的毛巾、理发（美容）用具大肠杆菌严重超标。

如图甲为大肠杆菌含量检测操作简图，图乙为伊红美蓝培养基配方。

回答下列相关问题：

（1）图甲中滤膜的孔径应________（填“大于”或“小于”）大肠杆菌。

受此启发，对某些不耐高温的试剂可以怎样除菌？

____________________________。

（2）配制图乙中的基础培养基时，除了水分、无机盐以外，还应加入________（一种营养成分），以及__________。

待各成分都溶化后和分装前，要进行的是__________和灭菌，对培养基进行灭菌的常用器具是_______________________________________________________________________。

倒平板时要待平板冷凝后，将平板倒置，其主要目的是____________________________________________。

伊红美蓝培养基上生长的大肠杆菌菌落呈现黑色，从功能上划分，该培养基属于________培养基。

（3）用平板划线法分离样液中的大肠杆菌，操作时，接种环通过灼烧灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线的目的是__________________________________。

要检测样液中的大肠杆菌含量，取25cm2毛巾样本，加5mL蒸馏水，浸润半小时，然后在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1mL样液；在37℃的培养箱中放置48小时，3个平板上的黑色菌落数分别为49、48和47。

据此可得出25cm2毛巾样液中的活菌数为________。

答案　

（1）小于用滤膜过滤除菌

（2）氮源琼脂调整pH高压蒸汽灭菌锅防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染鉴别（3）将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落2.4×103个

解析　

（1）图甲中滤膜的孔径应小于大肠杆菌，滤膜过滤才能获得大肠杆菌，对不耐高温的试剂除菌时无法用高压蒸汽灭菌法，可以用滤膜过滤达到除菌目的。

（2）配制图乙中的基础培养基时，除了水分、无机盐以外，还应加入氮源以及琼脂。

配制的培养基在溶化后和分装前需要先进行调pH和灭菌。

高压蒸汽灭菌法常用高压蒸汽灭菌锅对培养基等进行灭菌。

倒平板后将平板倒置的主要原因是防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染。

从功能上划分，伊红美蓝培养基属于鉴别培养基。

（3）接种环灼烧灭菌后，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线的目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。

在伊红美蓝培养基上，大肠杆菌的菌落呈黑色，据题意可知，25cm2毛巾样本中的活菌数为（49＋48＋47）÷3÷0.1×5＝2.4×103个。

技法提升

1.快速确认两类培养基

（1）鉴别培养基：

加入的物质起“鉴别”作用（该物质可能与被鉴别菌种发生特殊颜色反应），该物质加入后并未杀死其他微生物，其培养基中可生存多种微生物。

（2）选择培养基：

加入的物质起“筛选”作用，该物质可抑制或杀死其他微生物，只有被选择的“目的菌种”才能生存下来。

2．微生物实验室培养的注意事项

（1）平板划线法只适用于微生物的提纯，不适合进行计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。

（2）倒平板的温度一般在50℃左右适宜，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。

（3）平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又防止皿盖上的水珠落入培养基，造成培养基污染。

题型二　微生物的分离与计数

3．土壤中微生物种类繁多，功能强大，比如：

最显著的作用是分解有机质；把植物的残枝败叶和施入土壤中的有机肥料分解，改善土壤的结构和供给植物吸收。

若利用其中某种微生物，则需要进行菌种的分离和纯化。

以下示意图是从土壤中分离出分解尿素的微生物的流程图。

请分析相关问题：

（1）②过程所使用的接种方法是________________。

用该接种方法对微生物进行计数时，通常选用菌落数在__________个的平板进行计数，统计的菌落数往往比活菌的实际数目________，原因是______________________。

（2）从用途上来说，1号培养基属于________培养基，制备该培养基的步骤是：

计算→称量→溶化→________→倒平板。

（3）该实验中“酶活性鉴定”鉴定的是________的活性，可以加入________指示剂，如果指示剂变为________色，说明该酶的检测为阳性。

答案　

（1）稀释涂布平板法30～300少有的菌落会重叠被计数为一个菌落

（2）选择灭菌（3）脲酶酚红红

解析　

（1）在分离微生物时，①是将土壤样液连续稀释，②是采用稀释涂布平板法进行分离，实际操作时通常选用菌落数在30～300之间适于计数的平板。

因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往偏低。

（2）此图用于分离分解尿素的微生物，因此1号培养基属于选择培养基，制备的步骤是计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。

（3）分解尿素的细菌可以合成脲酶分解尿素生成氨，加入酚红指示剂后变红色。

4．[2017·贵阳一检]某研究小组的同学用所学的微生物的实验室培养的方法进行“变质牛奶中金黄色葡萄球菌的分离和计数实验”，部分实验处理和结果如图所示。

（注：

培养皿旁的数字代表菌落数目；实验条件适宜；实验操作规范等）请回答相关问题：

（1）在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供合适的________和________条件；另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。

（2）据图，研究小组采用的是____________法分离和计数金黄色葡萄球菌。

由样品到4号试管的操作中，第一步，将分别盛有9mL生理盐水的4支试管________，并编号1～4号；第二步，用移液管从样品中吸取1mL牛奶，注入1号试管中，充分摇匀；第三步，重复第二步骤操作，以此类推。

4号试管的稀释倍数是________。

（3）资料显示，金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10%～15%NaCl肉汤中生长。

本实验可配制含10%氯化钠的培养基，使之成为____________培养基，以利于金黄色葡萄球菌生长，抑制或阻止其他微生物的生长。

（4）在统计菌落数目时，需按照菌落计数的要求计数，以保证计数结果准确。

据图可得出1mL牛奶样品中金黄色葡萄球菌的活菌数为____________个。

答案　

（1）营养环境

（2）稀释涂布平板灭菌104（3）选择（4）3.6×105

解析　

（1）实验室培养微生物，既要为微生物提供营养和适宜温度等环境条件，还要防止被其他微生物污染。

（2）图示所用的分离方法是稀释涂布平板法；图示中每一次稀释都稀释了10倍，因此4号试管的稀释倍数为104倍。

（3）含有较高浓度NaCl的培养基属于选择培养基。

（4）图示中2号试管和4号试管稀释度下各有2个和1个培养皿，偶然性较大，应以3号试管稀释度的数据进行计算，即（32＋39＋37）÷3÷0.1×103＝3.6×105个。

技法提升

统计菌落数目方法的比较

（1）显微镜直接计数法

①原理：

利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法：

用计数板计数。

③缺点：

不能区分死菌与活菌。

（2）间接计数法（活菌计数法）

①原理：

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式：

每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。

③操作：

设置重复组，增强实验的说服力与准确性。

同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

高考真题再现

1.[2017·全国卷Ⅰ]某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。

回答下列问题：

（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________。

能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是______________________________________________________________________。

但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________（答出两点即可）。

（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是_________________________________________________。

（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有____________________________________________________________________________（答出两点即可）。

答案　

（1）脲酶　分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物　为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料

（2）尿素　其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用

（3）为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定

解析　

（1）有些细菌能分解尿素是因为这些细菌能产生脲酶，将尿素分解成CO2和NH3。

能分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2作为碳源合成有机物，但这些细菌可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是作为能源物质氧化分解为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料。

（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择尿素作为唯一氮源，这样只有能分解尿素的细菌才能在培养基上生存。

若选择“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”作为氮源，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用。

（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，它们可以为细菌生长提供无机营养；同时，KH2PO4和Na2HPO4还可以作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定。

2．[2016·全国卷Ⅰ]空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。

某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。

实验步骤如下：

①配制培养基（成分：

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）；

②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题：

（1）该培养基中微生物所需的氮来源于______________。

若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________________。

（2）步骤③中，实验组的操作是_________________________________________________。

（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。

若将30（即36－6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________（填“正确”或“不正确”）。

答案　

（1）牛肉膏、蛋白胨琼脂

（2）将实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间

（3）污染不正确

解析　

（1）牛肉膏、蛋白胨都含有N，可为微生物的生长提供氮源。

制作无菌平板所用培养基为固体培养基，所以X应为琼脂。

（2）根据实验目的可知，本实验的自变量为教室的不同高度，因变量为微生物的分布情况，故实验组的操作应为将实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间。

（3）空白培养基上出现菌落，说明培养基被污染了，即调查中出现了污染现象。

实验过程中若培养基被污染，必须将其抛弃，重新制作新的培养基进行实验。

3．[2016·全国卷Ⅲ]某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。

分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。

回答下列问题：

（1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是____________________________。

（2）推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有________和________。

分离纯化时应挑选出________的菌落作为候选菌。

（3）乳酸菌在－20℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的________（填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”）。

答案　

（1）无菌水　泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落

（2）鉴别乳酸菌　中和产生的乳酸（或酸）　具有透明圈

（3）甘油

解析　

（1）由于泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落，故分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释。

（2）由于乳酸菌代谢产生的乳酸可以溶解培养基中的碳酸钙，形成透明圈，故培养基中加入碳酸钙可用于鉴别乳酸菌，同时碳酸钙也可以中和乳酸菌产生的乳酸。

（3）乳酸菌在－20℃长期保存时，菌液中需要加入一定量的甘油，加甘油是为了避免水结冰产生冰晶损伤细胞。

4．[2015·全国卷Ⅰ]已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。

脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。

回答有关问题：

（1）显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用______染色。

微生物A产生的油脂不易挥发，可选用________（填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”）从菌体中提取。

（2）为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以________为碳源的固体培养基进行培养。

（3）若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用________法进行计数。

（4）为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35℃、40℃、45℃温度下降解10g油脂所需酶量依次为4mg、1mg、6mg，则上述三个温度中，________℃条件下该酶活力最小。

为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕________℃设计后续实验。

答案　

（1）苏丹Ⅲ（或苏丹Ⅳ）　萃取法　

（2）油脂

（3）血细胞计数板　稀释涂布平板　（4）45　40

解析　

（1）观察脂肪时可用苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染色，苏丹Ⅲ使脂肪呈橘黄色，苏丹Ⅳ使脂肪呈红色。

对于不易挥发的物质可用萃取法提取。

（2）为从自然界获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，应以油脂为唯一碳源进行选择培养。

（3）若要测定微生物菌体数，可在显微镜下利用血细胞计数板直接计数，该方法不能区分细菌的死活；若要测定其活菌数量，可用稀释涂布平板法获得单菌落，选择菌落数在30～300的平板进行计数。

（4）相同时间降解相等质量油脂所需酶量越多的温度条件下酶的活力越小，即45℃条件下酶的活力最小。

而40℃条件下酶的活力相对最大，故应围绕此温度设计后续实验，以进一步确定该酶的最适温度。

5．[2017·江苏高考]苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。

小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。

请回答下列问题：

（1）酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有________。

（2）将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。

若上图平板中菌落过于密集，应进一步________，以便于菌落计数与分离。

制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。

（3）下图为连续划线法示意图，在图中________（填图中序号）区域更易获得单菌落。

（4）采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。

先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为________。

管号

1

2

3

4

5

6

苯酚浓度（mg/L）

1

如果废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释________（填序号：

①5　②10　③20）倍后，再进行比色。

答案　

（1）蛋白胨、苯酚　

（2）增加　稀释涂布　凝固剂

（3）③　（4）0、0.2、0.4、0.6、0.8　③

解析　

（1）分析富集培养基的成分可知，培养基中蛋白胨、苯酚中含C，可作为碳源。

（2）转接的目的之一是富集降解苯酚能力强的酚降解菌，随转接次数增多，培养基中的苯酚含量应逐渐增加。

若接种培养后平板中菌落过于密集，应继续稀释涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离。

稀释涂布时所用的培养基为固体培养基，制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加琼脂等物质作为凝固剂。

（3）利用连续划线法接种时，越在最后划线区域，菌落的密度越小，越容易获得单菌落，所以，图中③区域更易获得单菌落。

（4）根据表中6号比色管中苯酚浓度为1mg/L可以推知，1～5号比色管的苯酚浓度应分别为0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L。

根据题意，废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1mg/L之间，需将残留液稀释20倍左右，再进行比色。

专题强化训练

1.[2017·甘肃兰州模拟]微生物分离技术在研究环境保护、水质净化、粮食储存和生物制药等方面都有重

要作用，回答下列相关问题：

（1）用纤维素粉作为唯一碳源制作培养基，可以分离能分泌________的微生物。

（2）灭菌的培养基在接种前，随机取空白平板于适宜温度下放置24小时，目的是____________________。

（3）划线用的接种环、涂布用的涂布器在接种之前都需要用________法进行灭菌。

能分离出单个菌落，并能够用来统计样品中微生物活菌数目的接种方法是________。

（4）需要振荡培养的微生物，要为培养的空间环境提供________，振荡培养能提高培养液中________的含量，还可以使菌体与培养液中的________充分接触，由此推测该种微生物的异化作用是________。

答案　

（1）纤维素酶　

（2）检测培养基的灭菌效果　（3）灼烧灭菌　稀释涂布平板法　（4）无菌空气　氧气　营养物质　需氧型

解析　

（1）用纤维素粉作为唯一碳源制作培养基可以分离能分泌纤维素酶的微生物。

（2）将灭菌后未接种的空白平板于适宜温度下放置24小时，观察是否会有菌落产生，从而检测培养基的灭菌效果。

（3）划线用的接种环、涂布用的涂布器在接种之前都需要用灼烧灭菌法进行灭菌。

平板划线法和稀释涂布平板法都能分离出单个菌落，但只有稀释涂布平板法能够用来统计样品中微生物活菌数目。

（4）需要振荡培养的微生物，要为培养的空间环境提供无菌空气，振荡培养能提高培养液中氧气的含量，还可以使菌体与培养液中的营养物质充分接触，由此推测该种微生物的异化作用是需氧型。

2．[2017·囊阳四中质检]某实验小组为了研究不同的碳源对纤维素分解菌分解纤维素能力的影响，以稻草粉、纤维素粉和滤纸浆为纤维素来源，研究了A、B、C、D四种纤维素分解菌，实验结果如下。

请回答下列问题：

（1）实验室培养基的营养成分除了碳源外还有________________，培养基灭菌的常用方法为________________。

接种微生物的常用方法有___