滴定终了时，稍过量的转化糖即将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体。
2，试剂
1）1％的次甲基兰指示剂
2）盐酸（水解作用）
3）10%和30%的NaOH溶液
4）1％铁氰化钾（贮存特色瓶，临用前标定）
标定步骤
称蔗糖1.0000gt定容500mR取此液50mR于100ml容量瓶加hcl5ml摇匀65-70C水裕15分钟取岀冷却-用30%NaOH中和t加水于刻度t倒入滴定管中t取10ml1%铁氰化钾于锥形瓶中t加10%
NaOH2.5ml加12.5ml的水加玻璃珠颗粒t加热至沸t保持一分钟t加次甲基兰1滴t立即以糖液滴足至蓝色
退去为止，记录用量。
正式滴定比较滴定时少0.5ml糖液，煮沸1分钟，加指示剂一滴，再用糖液滴定至兰色褪去，计算铁氰化钾溶液的浓度。
A=（W?
V）/（1000X0.95）
A:
相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的量（克）
V:
滴定时消耗的糖液的体积
W称取纯蔗糖的量
1000：
稀释比
0.95：
换算等数
3．操作方法
稀释10gT用100ml水作溶液T于250ml容量瓶加20%醋酸铅10mR至沉淀完为止加10ml10%NA2HPO4至不在产生沉淀为止t加水至刻度t过滤—取滤液50m|f于100ml容量瓶中乍按铁氰化钾标定法进行转化，
中和及滴定
计算糖含量
总糖（以转化糖计%）=（AX1000）/（W?
V）X
100
A:
相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的重量，
W样品的重量
V:
滴定时样液消耗的体积
4．实验应注意
（a）达终点时，过量的转化糖将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体，隐色体容量受空气中氧所氧化，很快
又变
成指示剂的颜色。
（b）整个过程应在低温电炉上进行，滴定要速度，否则终点不明显
（c）糖与硫酸反应脱水生成羟甲基咲喃甲醛，生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物，其颜色深浅与溶液中糖的浓度
成正比，单、双糖等糖类都直接于试剂发生作用，因此不需要水解。
（二）蒽铜的比色法
1.原理：
糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛，生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物，其颜色深浅与溶液中
糖的浓
度成正比，可比色定量。
2.试剂
（1）硫酸锌溶液：
溶解500g化学纯硫酸锌于500ml水中
（2）亚铁氰化钾溶液：
溶解10.6g化学纯亚铁氰化钾于100ml水中
（3）0.2%蒽铜试剂：
溶解蒽铜0.2g于100ml95%硫酸中，置棕色瓶中冷暗处保存
（4）0.1%葡萄糖液：
准确称干燥葡萄糖0.1000g定容100ml
3.操作方法
（1）标准曲线绘制
（2）100ml容量瓶编号
沸水浴加热6分钟，取岀冷却t用1cm比色杯t610nm测定吸光度t作岀以吸光度为横坐标，糖液浓度为纵
坐标的准
曲线
（3）样品测定
称10g样品t于100ml热水加入500ml容量瓶中—加硫酸锌5ml^沸水浴5分钟乍取岀再摇动下加亚铁氰化
钾5ml冷却t定容500mT过滤t吸滤液25mT于250ml容量瓶t定容250mT取稀释液1ml,于比色管
中t加10ml蒽铜试剂t摇匀t水浴加热6分钟t冷却t比色
试验注意
1,样液必须清澈透明,加热后不应有蛋白质沉淀
2,样品颜色较深时,可用活性炭脱色后再进行测定
3,此法与所用的硫酸浓度和加热时间有关
4,所取糖液浓度在1-2.5mg/100ml之间
二.还原糖的测定方法还原糖包括葡萄糖、果糖、麦芽糖,在葡萄糖分子中含有淤青的醛茎,在果糖分子中含有淤青的酮茎,在乳糖中和
麦芽糖中含有淤青的半缩羧茎,因此都有还原性。
在测定还原糖时一般测定总糖时所有将糖类水解为转化糖
再测定
的方法都可用来测定还原糖。
（一）斐林氏容量法
1.此法的原理、试剂、方法与总糖的测定方法相同。
只是样品溶液不必以过转化,而是直接取滤液进行滴
定,滤液进行滴定,滤液中的还原糖含量以在0.2-0.5%为好,又能通过增减样品量或改变稀释倍数来调
葡萄糖（无水）果糖或转化糖尿病乳糖尿病麦芽糖
2试剂
（1）斐林氏A液，称69.8gcp
（2）斐林氏B液,称34.6g.cp
节。
10毫升费林氏A、B液混合时理论上相当还原糖量如下：
0.0500克
0.0678克
0.0807克
硫酸铜于100ml水中,过滤备用
浓流锌钠和100gcpNaOH于1000ml水中，过滤备用3方法
称取样品10-20g：
制备与转化同铁氰化钾法。
将样液倒入滴管中，吸取A,B液准备预滴定
预滴定：
吸AB液各5mlT从滴管中加15ml样液t加热至沸t继续滴加样液t至兰色变潜t加3滴次甲基兰t在1
分钟内滴定到终点达到终点时，稍微过量的转化糖，将兰色的次甲基兰染色体还原为无色的隐色体，而显岀氧化亚铜的红色，去碱性条件下加热糖的产物是复杂的。
去碱性中断裂是由于碱度不同，加热时间不同，生产不等的碎片，这种碎片给后面滴定带来误差，而且，这种碎片与糖没有化合量的关系，所以，Lanecrol-EynonMethod作岀数据检索表
正式滴定：
吸A,B液各5mlT于三角瓶t加比预定量少0.5-1.0ml样液t2分钟内要求沸腾1分钟t加3滴指示剂t用样
液滴定兰色消失
总沸腾时间为3分钟，即滴定在3分钟完成。
计算：
还原糖=（F?
V2）/（W?
V1）X100
F:
转还糖回数，即与10ml斐林氏试液相当的转化糖毫克数，
V1:
样品试液总体积
V2:
样品试液滴定量
W样品重量
在测量乳糖制品时，若蔗糖与乳糖的含量比超过3：
1时，则应与滴定量中加上相关表中（课本中表9-8）校
正值后在进行计算我们举例如下：
如果标准果糖溶液度为每100ml溶液含糖262.5mg。
对于10ml斐林试液从9-5可以查得果糖液滴定应为
20ml。
如果不是20ml，可先算岀A,B液校正等数。
然后进行计算
再如标准糖溶液浓度为每100ml溶液含糖199.3ml，对于10mlA,B液从9-4中查到，糖液滴定量应为25.00ml，若有岀入可校正。
如果要求不高，可省略校正步骤但要求1％得测定误差，则省略校正。
另外有
时候并未根据检索表计算样含糖量，但对A,B液进行标定，以使确定相当得还原糖量。
这种误差为0.5％。
下面我们讲标定量A,B液
准确准确称取烘干冷却得A.R蔗糖1.5g-用水溶解称取250ml容量瓶中-定容-吸50ml于100ml定量瓶中
t加HCL5m-再65-70摄氏度水裕15分钟—冷却—用30%NaOH中和—定容
准确吸A,B液各5ml于三角瓶中-加水约50ml玻璃珠三粒-加热至沸-保持1分钟-加指示剂1滴-再煮
1分钟-立即用糖液滴定至兰色褪去，红色岀现即为终点正式滴定，先加入比预滴定时少0.5ml左右得糖液煮沸1分钟-加指示剂1滴-再煮沸1分钟-继续滴至终点
八、、
计算：
A=W*V/500X0.95
A:
相当于10ml斐林氏A、B液的转化糖的量
W称取蔗糖的质量
V：
滴定蔗糖的量
500：
稀释比
0.95：
换算等数
最后计算：
总糖（还原糖测定时样品溶液的消耗体积应该与标定葡萄糖标液的消耗体积相近，通过测定了解样品浓度是否合适，浓度过大或过小应该加以调整，使测定时消耗样品溶液量在10毫升左右；二是通过测定可知道此
溶液的大概消耗量，以便在正式的滴定时，预先加入比实际用量少1毫升左右的样液，只留下1ml左右的样
液在续滴定时加入，以便保证在1分钟内完成续滴定工作，提交预测定的准确度。
2.此实验影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度，煮沸时间和滴定速度一般煮沸时间短消耗糖多，反之，消耗糖液少，滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。
另外溶液碱度愈高，二价铜的还原愈快，因此必须严格控制反应的体积）以转化糖计%=（A*1000/W*V）*100
A:
同上
W制取样品的量
V:
滴定是时样品消耗量
1000：
是稀释倍数（100/50*500）
1.预测定的目的:
对样品溶液中还原糖浓度有一定要要求（0.1%左右），，使反应体系碱度一致。
热源一般
采用800W电炉，反应液在2秒内沸腾。
（二）KMNO（4高锰酸钾法）
1．原理，还原糖在碱性溶液中使铜盐还原成氧化亚铜，在酸性条件下，氧化亚铜能使硫酸铁还原为硫酸亚
铁，再用KMNO溶液滴定硫酸亚铁，即可标岀还原糖的量。
2.操作方法
（1）样品处理
a.乳糖:
包括乳制品以及含蛋白质的冷食类
称样2-5g（液体样25〜50ml于250ml容量瓶加水50ml~加A液10ml+1NNaOH4ml定容静置30
秒t过滤t弃去初液t可测还原糖及蔗糖用。
b.低酒度饮料:
麦精露、各类汽酒等饮料。
先暴气除COT取100m|T于蒸发皿中t用1NNaOH中和t沸水浴蒸至原体积四分之t转入250ml容量瓶t
加50ml水t摇匀t（加A液l0mlT加1NNaOH4ml）t加水至刻度t静置30秒t过滤。
c.含多量淀粉的食品:
婴儿食品、糕干粉、宝宝乐、代乳粉、饼干、面包、糕点等
称样10-20gT250ml容量瓶t加水200mT45度水浴加热1小时t不停摇动t冷后加水至刻度t静置t吸岀
清夜200ml于另一容量瓶（250ml）t加A液10ml+1NNaOH4mT静置30秒t过滤。
d.汽水、果露、国产七种可乐及可口可乐
处理COT吸样液100mT于250ml容量瓶t加水至刻度t可测还原糖及蔗糖。
（2）测定方法
取50ml处理的样液t于400ml烧杯t加AB液各25mlT加热在4min左右沸腾t再煮2minT趁热抽滤t用60C水洗烧杯和沉淀t直到洗液不成碱性t将抽滤的纸（或者石棉）及Cu2G＞转入原来烧杯t用25ml硫酸
铁溶液冲洗抽滤瓶t使冲洗液全部洗入原烧杯中t加水25mlT使Cu2O溶解t用0.1NKMnO4标液滴定至微红
色，同时用50ml水按上述方法做空白实验。
（3）计算
3.注意事项:
（1）煮沸后的溶液显红色不显兰色，则表示糖量高，可减少取样体积。
（2）在洗涤Cu2O的整个过程中应使沉淀上层保持一层水层，以隔绝空气，避免Cu2O被空气中的氧所氧化。
（3）此法适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液不受限制，准确度高，重现性好。
准确性和重现性都优于直接滴定法，但操作复杂、费时，需使用特制的高锰酸钾法糖类检索表。
（二）直接滴定法（斐林氏溶液法）
1.原理
样品经过处理除去蛋白质等杂质后，加入盐酸，在加热条件下使蔗糖水解为还原性单糖，用直接滴定法测定水解后
样品中的还原糖总量。
2.试剂
3.方法
（1）取过量样品进行提取，放入250ml容量瓶，加5ml醋酸锌和5ML亚铁氰化锌，定容，静止30分
后过滤，滤液备用。
（2）测定
样品预滴定：
取A、B液各5ml于三角瓶中加水10ml，玻璃珠数粒，加热在2分内沸腾，趁热滴定，滴定到兰色褪去，记
录用量。
正式滴定：
取A、B液各5mL于三角瓶t加玻璃珠三粒t从滴定管直接加比预滴定时少0.5-1.0ML样液，在2分沸腾，趁
热滴定兰
色褪去，记录，取三次平均值计算结果。
三．蔗糖的测定
1．原理：
样品除蛋白质后，其中的蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，用还原糖的测定方法，确定样品中蔗糖
的含
量。
实际上测定还原糖包括两部分：
一是样品中原有的还原糖、二是蔗糖经酸水解后的还原糖。
2．方法
吸还原糖样品处理稀释液50mlr于100ML容量瓶t加t于68-70度水浴上15分t冷却t加甲基红2滴t中
和t定容t
取此溶液按还原糖的测定方法测定。
2．计算
蔗糖%=F（100/V2-100/V1）/（WX50/250X1000）X100X0.95
式中：
F：
10ml斐林氏试液相当于转化糖的质量mg。
V1:
测定时消耗未经水解的样品稀释体积ml
V2:
测定时消耗经过水解的样品稀释体积ml
w:
原测定还原糖时样品的重量（G）
1000:
将毫升换算成克
0.95:
分子的蔗糖经水解后成为2分子的还原糖（一分子的葡萄糖和一分子的果糖）蔗糖的分子量为342,后来
成为2X180.则342/360=0.95.所以转化糖换算到蔗糖应乘以0.95.
四.纸上层析法.
在食品中,糖的组分较为复杂,在淀粉糖浆中含有麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖、麦芽四糖等多种组分.对于这
些食品中的各种组分,不可能用化学分析方法进行测定,而用物理分析方法进行测定.
纸层析应用于糖类的分离分析,它利用混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同速度移动而达到分离.
比移值Rf==组分展开的距离/溶剂展开的距离
糖的RF值的规律为：
单糖>双糖>三糖
戊糖>己糖
酮糖>醛糖
实验室常用的展开剂：
正丁醇:
HAc:
H2O==4:
1:
5
常用的显色剂：
0.1NAgNO3:
NH4OH（SN）=1:
1（灵敏度高，但斑点易扩散）
AgN03/丙酮:
NaOH/乙醇=1:
1（克服上面缺点）
（显色剂书上给岀许多，同学们可以自己看）
样品的处理可采用常规法如：
糖的提取和蛋白质的除去可看前面讲的。
根据Rf值可求岀各种糖的Rf与标准样品的Rf值进行比较，可确定岀糖的种类，也可进行定量，用斑点光密度定量法直接在滤纸上测定.用斑点面积校正进行定量
凯氏定氮
样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：
CH2COOH+3H2SQ?
2CO2+3SO2+4出0+NW⑴
2NH3+H2SO?
（NH4）2SO4
（2）
（NH4）2SO4+2NaOH?
2H2O+Na2SO+2NH3（3）
反应
（1）、
（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO作催化剂，K2SO以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强
酸。
【器材和试剂】
7.
酒精灯
（一）器材
8.
小玻璃珠
1.100ml凯氏烧瓶
9.
滴定管
2.改进型凯氏定氮仪
10.
洗瓶
3.50ml容量瓶
11.
锥形瓶
4.分析天平（电子天平）
12.
铁架台
5.烘箱
13.
普通面粉或其它样品
1.消化液30%"Q:
浓"SQ:
违0=3：
2:
1
2.30%NaOH溶液
3.2%H3BO溶液
4.混合催化剂（粉末K2SO4-CuSO4混合物）©SO与CuSO
以3：
1比例充分研细混匀。
5.0.01mol/L标准盐酸溶液
6.混合指示剂（田氏指氏剂）取0.1%甲烯蓝-无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶液200ml，混合，贮于棕色瓶中备用。
该指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变
色范围很窄（pH5.2〜5.6）且很灵敏。
7.蒸馏水
【实验步骤】
（一）改进凯氏定氮仪的构造和安装改进型凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室及冷凝器三部分组成。
蒸馏装置的结构如图所示，可分成三部分来叙述：
1.蒸汽发生器和反应室：
蒸汽发生器有3个开口（图中的3、4、5）；反应室有1个开口（图中的6）。
2.冷凝器和通气室：
冷凝器有2个开口（图中的9、10）；通气室有2个开口（图中的12、13）。
3.排水柱：
排水柱有3个开口（图中的15、16、17）。
安装时，按图的连接方式仔细安装在一平稳的实验台上。
先将主体部分固定在铁架台上，其底部放上电炉或酒精灯。
然后将5与13；4与16；12与15；6与7用橡皮管连接，并夹上自由夹。
最后长橡胶管连接进水口10和出水口17。
（二）样品处理
样品若是液体，如血清、稀释蛋清等，可取一定体积直接消化测定。
若是固体样品，一般是用100g该物质（干重）中所含氮的g数来表示（%。
因此在消化前，应先将固体样品中的水分除掉。
一般样品烘干的温度都采用105C,因为非
游离的水都不能在100C以下烘干。
取一定量磨细的样品放入已称重的称量瓶内，然后置于105C的烘箱内持续干燥4h。
用坩埚钳将称量瓶取岀放入干燥器内，
待降至室温后称重。
按上述操作继续烘干样品，每干燥1h重复称量一次，直至两次称量数值不变，即达到恒重。
精确称量
已达恒重的面粉0.1g，作为本实验的样品。
（三）消化
1.编号
取清洁干燥100ml凯氏烧瓶4个，标号后各加数粒玻璃珠。
2.加样
在1、2号瓶中各加样品0.1g，混合催化剂0.2g，消化液5ml。
注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。
在3及4号瓶中各加蒸馏水0.1ml代替样品，其它试剂同样品瓶，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。
3.加热消化
每个瓶口放一漏斗，在通风橱内，于电炉上加热消化。
开始消化时应以微火加热，不要使液体冲到瓶颈或冲岀瓶外，否则将严重影响测定结果。
待瓶内水汽蒸完，H2SO4开始分解并放岀SO?
白烟后，适当加强火力，使瓶内液体微微沸
腾而不致跳荡。
继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。
4.定容
消化完毕，静置，待烧瓶中液体冷却后，缓慢沿瓶壁加蒸馏水10ml，随加随摇。
冷却后将瓶内液体倾入50ml的容
量瓶中，并以少量蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，并加水稀释到刻度，混匀备用。
（四）蒸馏
1.蒸馏器的洗涤
（1）接通冷凝水，打开自由夹②先向蒸汽发生器中加入一定量的水（以排水管的高度为宜），并关闭自由夹②，用酒精灯将其加热烧开。
（2）将蒸馏水由加样漏斗加入反应室，关闭自由夹①，移开酒精灯片刻，可使反应室中的水自动吸岀，如此反复清洗3〜5次。
（3）清洗后在冷凝管下端放一盛有5ml2%H3BO3溶液和1〜2滴指示剂混合液的锥形瓶。
蒸馏数min后，观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。
2.蒸馏
（1）取50ml锥形瓶3个，各加入2%H3BO3溶液5ml和指示剂1〜2滴，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。
（2）关闭冷凝水，打开自由夹②，使蒸汽发生器与大气相通。
将上述已加试剂的锥形瓶放在冷凝器下面，并使冷凝器下端浸没在液体内。
（3）用移液管取消化液5ml，打开自由夹①，细心地从加样漏斗下端加入反应室，随后加入30%NaOI溶液5ml，关闭自由夹①；在加样漏斗中加少量水做水封，以防止气体从漏斗处逸岀。
（4）关闭自由夹②，打开冷凝水（注意不要过快过猛，以免水溢岀）。
当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时（约2〜3min），
开始计时，蒸馏3min，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏
1min，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。
（5）蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前述。
打开自由夹③，将水放岀，再加热，再清洗，如此3〜5次。
最后将自
由夹①、③同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉。
关闭夹子，再使蒸汽通过整个装置数min后，继续下一次蒸馏。
待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。
3.滴定
淡紫色。
4.计算样品中总氮量可按如下公式计算：
式中：
c:
为标准盐酸溶液摩尔浓度；
V1：
为滴定样品用去的标准盐酸溶液的平均体积（ml）；
V2:
为滴定空白消化液用去的标准盐酸溶液的平均体积（ml）；
W为样品质量（g）；14：
为氮的相对原子质量。
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量（%）=总氮量X6.25
若样品中除有蛋白质外，尚含有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。
蛋白氮=总氮-非蛋白氮蛋白质含量（g%）=蛋白氮X6.25
【要点提示】
1.本实验时间较长，需要8〜10学时。
所以做该实验时，建议分为2次完成。
第1次完成步骤（三）消化，该步骤所需时
间较长；第2次从步骤（四）蒸馏做起。
2.一般样品消化终点为溶液呈透明淡绿色或无色透明，若带有黄色表示消化不完全；另一方面，消化液的颜色亦常因样品
成分的不同而异。
因此，每测一新样品时，最好先试验一下需多少时间才能使样品中的有机氮全部变成无机氮，以后即以
此时间为标准。
本实验到消化液呈透明淡绿色时即消化完全，消化时间过长，会引起氨的损失，同样影响测定结果。
3.如果蛋白质样品中含赖氨酸或组氨酸（如蚕蛹蛋白质）较多，则消化时间要延长1〜2倍；为了缩短消化时间，可在催化剂
中再加少量HgCl2（约0.032g/g催化剂），则赖氨酸中的氮4〜5h可消化完全，组氨酸约需8h左右才能消化完全。
4.NH3蒸馏时，为了使所有（NH4）2SO4都分解放出NH3，必须加入足量的30%NaOH。
加入时应缓慢，碱加入后，有
Cu（NH3）2+、Cu（OH）2或CuO
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