荧光定量PCR原理及应用科研版_精品文档.ppt

荧光定量PCR原理及应用科研版_精品文档.ppt

《荧光定量PCR原理及应用科研版_精品文档.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光定量PCR原理及应用科研版_精品文档.ppt（138页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

东胜创新生物科技有限公司东胜创新生物科技有限公司东胜创新生物科技有限公司东胜创新生物科技有限公司实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介技术简介应用工程师应用工程师张晓辉张晓辉东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之OUTLINEOUTLINE实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理荧光定量荧光定量PCR仪简介仪简介实时荧光定量实时荧光定量PCR在科研上的应用在科研上的应用实时荧光定量实时荧光定量PCR实验设计实例实验设计实例东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理OUTLINEOUTLINE实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理：

的原理：

什么是实时荧光定量PCR荧光化学双通道与内标基因分型（SNP）检测东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理常规常规PCRPCR技术：

技术：

PCR后借助电泳对扩增反应的后借助电泳对扩增反应的终产终产物物进行定量及进行定量及定性定性分析分析DNAEngineS1S2M常规常规常规常规PCRPCR东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理常规常规常规常规PCRPCR常规常规PCRPCR结合结合电泳分析方法的缺点电泳分析方法的缺点只能对终产物进行分析只能对终产物进行分析,无法对起始模板准确定量无法对起始模板准确定量必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析,费时费事费时费事无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测EB有毒有毒东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新Opticon实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理定量定量PCRPCR技术：

技术：

利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应扩增反应中中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，通过，通过Ct值值和标准曲线实现对和标准曲线实现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析定量定量定量定量PCRPCR东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理实时荧光定量实时荧光定量PCR三个关键词：

三个关键词：

实时，荧光，定量实时，荧光，定量如何如何实时实时检测？

检测？

借助借助荧光荧光物质示踪扩增产物量的变化物质示踪扩增产物量的变化定量定量定量定量PCRPCR东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理在PCR反应加入能示踪扩增产物的荧光化学物质，随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。

每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图，从而通过荧光强度变化实时监测产物量的变化荧光曲线荧光曲线荧光曲线荧光曲线东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新如何对起始模板定量？

如何对起始模板定量？

通过通过Ct值值和标准曲线实现对和标准曲线实现对起始模板起始模板的的定量分析定量分析引入两个概念：

引入两个概念：

荧光阈值、荧光阈值、Ct值值实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理定量原理定量原理定量原理定量原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新荧光阈值荧光阈值荧光阈值荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准光强度标准（即即PCRPCR扩增产物量的标准扩增产物量的标准）ThresholdlineC（t）value实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理定量原理定量原理定量原理定量原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理定量原理定量原理定量原理定量原理CtCtCtCt值的概念值的概念值的概念值的概念Ct值的定义是值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数次数ThresholdlineC（t）value东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新qLogLog浓度与循环数呈线性浓度与循环数呈线性关系关系q初始初始模板量越多模板量越多,扩增产扩增产物达到某一值（域值）物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少时所需要的循环数越少确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理定量原理定量原理定量原理定量原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理定量原理定量原理定量原理定量原理理想的PCR反应：

X=X0*2n非理想的PCR反应：

X=X0（1+Ex）nn：

扩增反应的循环次数X：

第n次循环后的产物量X0：

初始模板量Ex：

扩增效率东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新定量原理定量原理实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理在扩增产物达到阈值线时:

XCt=X0（1+Ex）Ct=N

（1）XCt:

荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式

（1）两边同时取对数得:

logN=logX0（1+Ex）Ct

（2）整理方程式

（2）得:

logX0=-log（1+Ex）*Ct+logN（3）LogLog浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新定量原理：

利用已知起始拷贝数的标准样品作定量原理：

利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线出标准曲线,通过未知样品的通过未知样品的CtCt值值,从标准曲线上从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。

计算出该样品的起始浓度。

如何定量如何定量荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C（T）循环数标准曲线循环数标准曲线.未知未知10410310610510210实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新DetermineC（t）valueforunknownDetermineC（t）valueforunknownInterpolatequantityofunknownInterpolatequantityofunknownusingthestandardcurveusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copies实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理阈值的选择阈值的选择阈值的选择阈值的选择荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-153-15个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的1010倍倍东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理为什么要用为什么要用为什么要用为什么要用CtCtCtCt值定量值定量值定量值定量实时荧光定量实时荧光定量PCR方法利用方法利用CtCt的概念，的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该样品间的细小误差尚未放大，因此该CtCt值具有极好的重复性。

值具有极好的重复性。

东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理相同模板在同一台相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复仪上相同条件下重复96次次扩增的扩增曲线图扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性值则极具重现性CtCt值的重现性值的重现性东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之与传统与传统与传统与传统PCRPCR的比较的比较的比较的比较AbsolutequantificationispossibleAbsolutequantificationispossibleSensitiveSensitiveDetectslowercopiesoftargetDetectslowercopiesoftargetDetectssmallfolddifferencesDetectssmallfolddifferencesSampleswithabroadrangeofSampleswithabroadrangeofconcentrationsareanalyzedwithoutconcentrationsareanalyzedwithoutnormalizingconcentrationnormalizingconcentrationCosteffectiveandtimeefficientCosteffectiveandtimeefficientFlexibleassaydesignFlexibleassaydesign东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理OUTLINEOUTLINE实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理：

的原理：

什么是实时荧光定量PCR荧光化学双通道与内标基因分型（SNP）检测东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR原理原理原理原理示踪扩增产物量变化的示踪扩增产物量变化的荧光物质荧光物质及及其其工作原理工作原理东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新qSYBRGreen1qMolecularBeaconsqTaqMan荧光化学荧光化学荧光化学荧光化学MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新SYBRGreenISYBRGreenISYBRGreen1SYBRGreen1MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新SYBRGreenISYBRGreenI工作原理工作原理工作原理工作原理MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之仪之仪之qSYBRGreen1结合到双链DNA的小沟部位qSYBRGreen1染料只有和双链DNA结合后才发荧光。

GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA东胜创新东胜创新东胜创新东胜创新BoundSYBRGree