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细胞破碎技术细胞破碎技术孙万儒孙万儒中国科学院微生物研究所中国科学院微生物研究所前前言言细胞破碎是了解细胞组成和结构细胞破碎是了解细胞组成和结构,获得细胞内获得细胞内含物的必要手段。

含物的必要手段。

胞内的生物活性物质的稳定性差胞内的生物活性物质的稳定性差,条件不适极条件不适极易失活。

特别是微生物细胞十分微小易失活。

特别是微生物细胞十分微小,细胞壁细胞壁结构比较紧密结构比较紧密,一般方法不易将细胞打破一般方法不易将细胞打破,有有些技术虽然可以些技术虽然可以,但条件严苛但条件严苛,胞内生物活性胞内生物活性物质在此条件下很易失活物质在此条件下很易失活,限制了一些技术的限制了一些技术的应用。

应用。

在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。

关键技术。

破碎细胞的方法和技术破碎细胞的方法和技术细胞破碎方法细胞破碎方法物理法物理法化学法化学法渗透渗透超声超声高压高压球磨球磨研磨研磨碱处碱处酶法酶法有机有机表面表面休克休克波法波法释放释放法法法法理法理法溶剂溶剂活性活性法法法法法法剂法剂法细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构微生物细胞外膜使细胞具有刚性的外形微生物细胞外膜使细胞具有刚性的外形,由胞质膜和细胞壁组成由胞质膜和细胞壁组成,其结构影响着细胞破其结构影响着细胞破碎。

碎。

胞质膜保持着细胞内外的物质浓度梯度胞质膜保持着细胞内外的物质浓度梯度,主要由蛋白质和脂类组成。

没有细胞壁时主要由蛋白质和脂类组成。

没有细胞壁时,膜膜对渗透休克敏感对渗透休克敏感,对对其它破碎方法影响较小。

其它破碎方法影响较小。

细胞壁是破碎的主要障碍细胞壁是破碎的主要障碍,其其组成和结构组成和结构对细胞破碎有重要影响。

细胞壁的组成和结构对细胞破碎有重要影响。

细胞壁的组成和结构与遗传和环境因素有关与遗传和环境因素有关,但在微生物的种属中但在微生物的种属中也存在总结构上的相似性。

也存在总结构上的相似性。

细菌细胞壁的组成细菌细胞壁的组成1964年年Salton首次利用机械破碎法破碎细首次利用机械破碎法破碎细菌细胞，对细菌细胞壁组成、结构和功能进菌细胞，对细菌细胞壁组成、结构和功能进行研究。

对格兰氏阳性菌和格兰氏阴性菌的行研究。

对格兰氏阳性菌和格兰氏阴性菌的细胞壁结构有了较为全面认识。

细胞壁结构有了较为全面认识。

除了菌质和一些除了菌质和一些L-型和嗜盐菌以外，几型和嗜盐菌以外，几乎所有的细菌的壁的较坚硬部分都是由短肽乎所有的细菌的壁的较坚硬部分都是由短肽交联的糖原链，即粘肽构成，围绕着细胞形交联的糖原链，即粘肽构成，围绕着细胞形成连续的网状结构，使细胞具有一定的形状成连续的网状结构，使细胞具有一定的形状和强度。

和强度。

细菌细胞壁的组成细菌细胞壁的组成细菌粘肽结构示意图细菌粘肽结构示意图N-乙酰基胞壁酸（M）和N-乙酰基葡萄糖胺（G）交替形成糖原束,由M引出的纵点代表四肽单元的氨基酸残基，横点代表肽交联桥细菌细胞壁的组成细菌细胞壁的组成不同物种的不同物种的N-乙酰基胞壁酸在其侧链基团乙酰基胞壁酸在其侧链基团上的取代有变化。

但对糖原链的三维结构没有上的取代有变化。

但对糖原链的三维结构没有明显影响。

明显影响。

N-乙酰基胞壁酸残基的乳酸基与肽乙酰基胞壁酸残基的乳酸基与肽链结合，将糖原链联结起来形成网状结构。

链结合，将糖原链联结起来形成网状结构。

至少至少N-乙酰基胞壁酸残基的乳酰基部分可乙酰基胞壁酸残基的乳酰基部分可为四肽单元取代，相邻的糖原链由肽桥交联。

为四肽单元取代，相邻的糖原链由肽桥交联。

大肠杆菌大约有大肠杆菌大约有50%的四肽单元未交联，其它的四肽单元未交联，其它的仅作为二聚体交联。

在嗜酸乳酸菌中，大约的仅作为二聚体交联。

在嗜酸乳酸菌中，大约有有90%的四肽单元交联，约的四肽单元交联，约30%的四肽单元作的四肽单元作为三聚体交联。

为三聚体交联。

细菌细胞壁的组成细菌细胞壁的组成虽然几乎所有的细菌都含有基本的粘肽网虽然几乎所有的细菌都含有基本的粘肽网结构，但格兰氏阳性和阴性细菌的壁结构有明结构，但格兰氏阳性和阴性细菌的壁结构有明显不同。

格兰氏阳性菌的壁相当厚，约显不同。

格兰氏阳性菌的壁相当厚，约15-50nm，含有含有40-90%的由基础多糖和磷壁酸质组的由基础多糖和磷壁酸质组成的粘肽，成的粘肽，一些种属的细胞表面有规律地排列一些种属的细胞表面有规律地排列着蛋白质亚基。

着蛋白质亚基。

格兰氏阴性菌细胞壁由薄的粘肽层格兰氏阴性菌细胞壁由薄的粘肽层（1.5-（1.5-2.02.0nm）nm）和在电子显微照片上看如同胞质膜一样和在电子显微照片上看如同胞质膜一样的外膜组成，粘肽层上还共价结合有脂蛋白，的外膜组成，粘肽层上还共价结合有脂蛋白，一些种属在外膜上另外还有一层规律排列的蛋一些种属在外膜上另外还有一层规律排列的蛋白质亚基。

白质亚基。

酵母细胞壁酵母细胞壁酵母细胞壁结构更难加以说明。

总的结构要比格兰酵母细胞壁结构更难加以说明。

总的结构要比格兰氏阳性菌的厚些。

面包酵母细胞壁大约为氏阳性菌的厚些。

面包酵母细胞壁大约为70nm，且随且随培养时间的增加细胞壁加厚。

培养时间的增加细胞壁加厚。

酵酵母母细细胞胞壁壁含含有有大大量量葡葡聚聚糖糖，甘甘露露聚聚糖糖和和蛋蛋白白质质，但但不不清清楚楚以以怎怎样样的的方方式式结结合合形形成成基基本本结结构构。

在在葡葡聚聚糖糖链链上上有有（11,33）和和（11,66）键键联联结结的的分分支支链链结结构构。

酵酵母母细细胞胞壁壁的的甘甘露露聚聚糖糖主主要要是是由由（11,22）糖糖苷苷键键和和少少量量的的（11,33）糖糖苷苷键键联联结结的的甘甘露露糖糖组组成成，另另外外，也也有有通通过过（11,66）糖糖苷苷键键联联结结的的甘甘露露寡寡糖糖侧侧链链，在在甘甘露露糖糖残残基基上上有有时时也也有有磷磷酸酸二二酯酯键键。

在在酵酵母母细细胞胞壁壁上上发发现现的的蛋蛋白白质质主主要要是是与与甘甘露露糖糖复复合合，多多数数是是酶酶，而而不不是是结结构构组组分分。

酵母细胞壁酵母细胞壁格兰氏阳性（a）和阴性（b）细菌的细胞壁的横断面图CM代表胞质膜;CW为细胞壁结构;SU为有规律排列的亚基;PG为粘肽层;OM为格兰氏阴性菌的外膜；类型不同，亚基可能存在也可能不存在。

酵母细胞壁酵母细胞壁酵母细胞壁结构示意图酵母细胞壁结构示意图外层甘露聚糖（M）通过磷酸二酯键与蛋白（P）结合，内部蛋白含有交联的糖原（G）真菌细胞壁真菌细胞壁大多数真菌的细胞壁是由多糖和少量的大多数真菌的细胞壁是由多糖和少量的蛋白质及脂类组成，但组成变化很大，只有个蛋白质及脂类组成，但组成变化很大，只有个别的真菌细胞壁作了较详细研究。

正如细菌和别的真菌细胞壁作了较详细研究。

正如细菌和酵母一样，多糖是构成细胞形状和耐受破碎的酵母一样，多糖是构成细胞形状和耐受破碎的主要结构物。

主要结构物。

真菌细胞壁组成和结构的多样性，真菌细胞壁组成和结构的多样性，不能不能将一个种属的结果推广到另一个种属上。

从影将一个种属的结果推广到另一个种属上。

从影响细胞破碎的角度看，有其共同点，就是菌丝响细胞破碎的角度看，有其共同点，就是菌丝体生长过程中细胞壁的变化对细胞破碎的影响。

体生长过程中细胞壁的变化对细胞破碎的影响。

细胞壁组分与真菌分类细胞壁组分与真菌分类关键多糖关键多糖分类组分类组纤维素，糖原集胞（粘）菌纲（Acrasiomycetes）纤维素，-葡聚糖卵菌目（Oomycetes）,水霉目（Saprolegnicales）霜霉目（Peronosporales）,水节霉目（Leptomitales）纤维素，壳多糖，卵菌目（Oomycetes）,水节霉目（Leptomitales）-葡聚糖纤维素，壳多糖丝壶菌目（Hyphochytridiomycetes）去乙酰基壳多糖，接合菌目（Zygomycetes）壳多糖壳多糖，-葡聚糖壶菌目（Chytridiomycetes）,子囊菌目（Ascomycetes）,除了半子囊菌亚纲（Hemiascomycetidae）,担子菌纲Basidiomycetes）除了掷孢酵母科（Sporobolomycetaceae）甘露糖,-葡聚糖半子囊菌纲（Hemiascomycetidae）甘露糖,壳多糖红酵母科（Rhodotorulaceae）真菌细胞壁真菌细胞壁粗糙脉孢菌的细胞壁结构示意图粗糙脉孢菌的细胞壁结构示意图层次组成：

层次组成：

（a）最外层由最外层由-和和-葡聚糖混合葡聚糖混合组成组成,（b）葡聚糖组合在蛋白类材料中的糖葡聚糖组合在蛋白类材料中的糖蛋白网络蛋白网络,（c）主要是蛋白质类物质主要是蛋白质类物质,（d）内内部的壳多糖类物质区，嵌镶在蛋白类物质部的壳多糖类物质区，嵌镶在蛋白类物质中的微原纤维壳多糖。

中的微原纤维壳多糖。

真菌细胞壁真菌细胞壁裂褶菌裂褶菌（Schizophyllumcommune）细胞壁的细胞壁的组分虽然与之不同，但具有相同的层次结构。

三组分虽然与之不同，但具有相同的层次结构。

三种聚合物种聚合物（R）-葡聚糖，葡聚糖，（S）-葡聚糖和壳多糖大约葡聚糖和壳多糖大约占细胞壁干重的占细胞壁干重的70%，（R）-葡聚糖是一个高分枝葡聚糖是一个高分枝聚合物，分支点为聚合物，分支点为（1,3）和和（1,6），且与壁的惰性且与壁的惰性层中的微原纤维壳多糖复合。

层中的微原纤维壳多糖复合。

真菌细胞壁的强度与聚合物的网状结构有关，真菌细胞壁的强度与聚合物的网状结构有关，至少含有的纤维状的壳多糖和纤维素对细胞强度至少含有的纤维状的壳多糖和纤维素对细胞强度有增强作用。

有增强作用。

细胞壁结构与破碎细胞壁结构与破碎微生物细胞壁的形状和强度与壁内结构聚合物微生物细胞壁的形状和强度与壁内结构聚合物的结构和它们彼此之间交联及与其它组分的交联程的结构和它们彼此之间交联及与其它组分的交联程度有关。

为达到破碎细胞目的，必须打破这种共价度有关。

为达到破碎细胞目的，必须打破这种共价结合的网状结构。

这种结构不仅与其遗传特性有关，结合的网状结构。

这种结构不仅与其遗传特性有关，也与其生长环境和生长阶段有关，而真菌的细胞壁也与其生长环境和生长阶段有关，而真菌的细胞壁结构还和发酵时的机械作用有关，因此表现为极其结构还和发酵时的机械作用有关，因此表现为极其丰富的多样性。

丰富的多样性。

利用机械破碎细胞时，细胞的形状和大小，细胞利用机械破碎细胞时，细胞的形状和大小，细胞壁结构聚合物的交联程度均是决定破碎难易的重要壁结构聚合物的交联程度均是决定破碎难易的重要因素。

要预知各种微生物细胞对机械破碎的耐受能因素。

要预知各种微生物细胞对机械破碎的耐受能力也有困难。

力也有困难。

细胞壁结构与破碎细胞壁结构与破碎利用化学法和酶法破碎细胞时，了解细利用化学法和酶法破碎细胞时，了解细胞壁的组成和结构对选择具体方法显得十分重胞壁的组成和结构对选择具体方法显得十分重要。

由于在网状结构之上覆盖有保护层，掌握要。

由于在网状结构之上覆盖有保护层，掌握它们的结构组成和非结构组成是选择酶和化学它们的结构组成和非结构组成是选择酶和化学方法的依据。

然而，有关这些方面的知识还十方法的依据。

然而，有关这些方面的知识还十分有限，还需使用其它方法对这种精细结构进分有限，还需使用其它方法对这种精细结构进行更有效的研究。

行更有效的研究。

破碎分析破碎分析破碎细胞的目的主要有二，一是获得细胞破碎细胞的目的主要有二，一是获得细胞的内含物，二是获得细胞膜物质。

不论是那一的内含物，二是获得细胞膜物质。

不论是那一种目的，获得最大的破碎率是所有破碎技术追种目的，获得最大的破碎率是所有破碎技术追求的目标。

求的目标。

为了检测破碎过程和破碎结果，需要快速、为了检测破碎过程和破碎结果，需要快速、简捷的细胞破碎程度的分析技术。

细胞破碎率简捷的细胞破碎程度的分析技术。

细胞破碎率可直接利用完整细胞计数法或质量检测法，也可直接利用完整细胞计数法或质量检测法，也可利用细胞释放出来的特定组分间接测定。

可利用细胞释放出来的特定组分间接测定。

直接测定法是标准化法，间接测定法可能直接测定