实验四PCR产物的T载体克隆和转化_精品文档.ppt

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医用分子生物学实验技术,青海大学医学硕士研究生课程,重组DNA技术操作步骤,基本原理,主要步骤：

制备目的基因和选择相关载体目的基因和有关载体进行连接重组的DNA导入受体细胞DNA重组体的筛选和鉴定DNA重组体的扩增、表达和其他研究,以质粒为载体的DNA克隆过程,（三）PCR扩增特定基因,（四）人工合成,一、目的基因的获得分,

（一）从基因组文库中获得,

（二）从cDNA文库中获得,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组DNA文库获取目的基因,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,从cDNA文库获取目的基因,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。

几种常用克隆载体的比较,注：

+表示可用；-表示不可用,比较内容质粒噬菌体黏性质粒M13噬菌体克隆容量10kb22kb4050kb1kb基因组DNA文库-+-cDNA文库+-亚克隆+-+序列分析+-+E.coli表达+-,二、载体的选择与准备选,三、DNA分子的体外连接接,

（一）黏性末端,

（二）人工接头的使用,（三）加入同聚体尾,（四）平端连接,

（一）黏性末端,

（二）人工接头,（三）加入同聚体尾,待克隆DNA片段,重组质粒,混合、退火,空白质粒,（四）平端连接,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,53T（T）nT,T（T）nT35,3A（A）nA,A（A）nA,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶+dATP,末端转移酶+dTTP,5,35,四、外源DNA导入宿主细胞转,受体菌条件：

安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态（competent）,导入方式：

转化（transformation）转染（transfection）感染（infection）,外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。

所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。

五、目的基因的筛选和鉴定筛,1.借助载体上的遗传标志进行筛选

（1）利用抗生素抗性标志筛选

（2）利用基因的插入失活/插入表达特性筛选（3）利用标志补救筛选（4）利用噬菌体的包装特性进行筛选,2.序列特异性筛选

（1）RE酶切法

（2）PCR法（3）核酸杂交法（4）DNA测序法,

（一）遗传学方法,1.插入灭活法,插入失活筛选带有重组载体的克隆,2.蓝-白筛选（互补）,许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。

这个编码区中插入了一个多克隆位点。

这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。

宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。

如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lacZ基因灭活，不能生成有活性的-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。

互补筛选（蓝-白筛选）,PCR产物的T载体克隆和转化,实验目的：

学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。

实验要求：

掌握利用T载体克隆PCR产物的方法；复习连接实验流程。

技术应用：

目的基因片段与T载体DNA连接，达到克隆基因的目的。

材料：

目的基因片段（回收的PCR产物）药品：

pEMGT-Vector（Promega公司）,质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。

大小约为数千碱基对。

常有13个抗药性基因，以利于筛选。

质粒载体,克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。

主要是DNA水平上的操作。

基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。

实验原理,普通Taq酶会在3末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3端均有一个单链状态的A；T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3端均有一个单链状态的T；二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。

载体结构的三大要素：

多克隆位点选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位,pGEM-T载体的结构,pGEM-TEasy载体的结构,实验步骤,

（1）目的片段的制备-胶回收法回收PCR产物：

（2）连接实验：

在0.2mlPCR管加入以下试剂：

目的片段（100ng/ul）3lpGEM-TEasy（50ng/ul）1lT4DNALigase1l2RapidLigationBuffer5lTotal10L备注：

混合均匀，瞬时离心。

4连接16小时，-20储存或直接用于转化。

说明,1.回收DNA片段可以用沉淀法，但是只适用于PCR扩增产物为单一片段，而且需要检测PCR扩增结果后进行；2.此种连接方法是根据普通Taq酶会在3末端加一个A的原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性强的Taq酶会自动切除末端的A，所以，这种酶的扩增产物需要补加A后再连接。

3.T-载体的阳性克隆筛选同样可以使用“蓝白斑”法，方便，快捷。