学术讲座免疫组化_精品文档.ppt

学术讲座免疫组化_精品文档.ppt

《学术讲座免疫组化_精品文档.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《学术讲座免疫组化_精品文档.ppt（41页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

1,免疫组化技术及操做关键介绍,2,染色原理,免疫组化染色,Ag,Ab,报告,提高敏感性减少非特异性,3,染色原理,免疫组化染色,一抗,二抗+,示踪剂,显色,直接法间接法ABC法LSABSPEnvision法,4,5,卵白素（avidin）：

鸡蛋白中的一种碱性蛋白，分子量为68kD，属于糖蛋白。

生物素（biotin），机体中的一种物质，又叫维生素H。

Avidin和biotin之间有很强的天然的亲和性。

一个avdin分子有4个biotin的结合位点。

Biotin还可以和抗体IgG的Fc段结合，不影响IgG的活性。

同时，生物素经活化后也可和过氧化物酶或ALP等结合，而不影响酶的活性。

6,（avidin-biotin-peroxidasecomplex，ABC）,可接150个Biotin,临时混合,7,链霉亲和素（streptavidin），从链霉菌培养物中提取，比avidin更好。

等电点接近于6.5，近中性，与被检查组织的非特异结合很少。

与Biotin形成复合物，穿透组织能力强。

用streptavidin替代avidin的技术SABC法SP法（Streptavidin-Peroxidase）,受内源性生物素和过氧化酶影响,8,Envision法（标记的葡聚糖聚合物法）最敏感的方法，不受内源性生物素影响,葡聚糖聚合物,EnVision系统是将二抗和酶联接成一个多聚体（即EnVision）直接放大信号40-50倍，再与已经结合的一抗反应，最后显色剂显色。

9,一抗：

鼠抗、兔抗二抗：

抗鼠、抗兔、兔鼠同抗示踪剂：

金属、荧光素、酶（辣根过氧化物酶HRP常用）,抗体及示踪剂介绍,10,组织处理染色读片,冰冻切片石蜡包埋、切片固定、脱水、包埋切片,染色前的处理染色封片,技术流程,11,载玻片用多聚赖氨酸或APES防脱片处理5um连续切片，室温保存，使用前60烤1小时,12,13,染色前处理脱蜡到水抗原修复（Antigenretrieval）-暴露抗原0.01M、pH6.0柠檬酸缓冲液微波炉、高压锅、高压灭菌锅、电炉微波炉法缓冲液倒进烧杯，加热煮沸放入切片（耐高温塑料架），继续煮10分钟（定时）切断电源，烧杯放在流水中冷却缓冲液倒掉，倒入蒸馏水洗两次,14,切片放在金属架上（不宜太密）*高压锅加入0,01M枸橼酸钠缓冲液3L,煮沸*金属架放在枸橼酸钠缓冲液内,加盖,加压1-5*自来水浴冷却高压锅*自来水洗-Trisbuffer,抗原修复高压,15,抗原修复是免疫组化发展史上的一个里程碑甲醛固定造成蛋白之间交联，加热打断交联物暴露抗原，达到修复的目的。

现在，抗原修复已应用到流式细胞术、原位杂交、免疫电镜等过程中。

石善溶抗原修复技术研究进展中华病理学杂志2007，36

（1）：

7,16,蛋白酶消化*0.1%胃蛋白酶30*0.01-0.1%胰蛋白酶15-2小时*0.0025%链酶蛋白酶4-6,抗原修复酶法,17,染色前处理脱蜡到水抗原修复内源性过氧化物酶阻断（简称阻断）,18,内源性HRP和BIOTIN,内源性HRP分布:

脑,脾,中性WBC,巨噬细胞血红蛋白和肌红蛋白含有铁卟啉具有内源性HRP活性,内源性HRP消除3%H2O2,5常用0.3%H2O2甲醇溶液,15常用0.1%HCl酒精溶液,300.2%醋酸甲醇溶液,300.01%过碘酸5-10,0.1%硼酸钠10,19,染色前处理脱蜡到水抗原修复内源性过氧化物酶阻断（简称阻断）内源性生物素封闭（简称封闭）,内源性生物素,20,

（1）冰冻组织中存在内源性生物素。

（2）经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭。

（3）加热抗原修复可造成内源性生物素暴露。

（4）内源性生物素暴露的强度各不相同。

（5）内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中。

（6）内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织，亦存在部分非上皮组织。

（7）内源性生物素不仅存在人体组织，也存在大鼠组织。

（8）内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为：

柠檬酸、EDTA、EGTA。

（9）热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭。

21,1、进行内源性生物素封闭，并成为常规。

可采用蛋清或卵白素作为封闭剂。

2、或采用非生物素检测系统，如EnVision等。

3、应坚持使用阴性对照。

内源性biaotin去除,22,染色前处理脱蜡到水抗原修复内源性过氧化物酶阻断（简称阻断）内源性生物素封闭（简称封闭）设置对照,阴性对照：

缓冲液、免疫前血清、吸收试验明确没有被测抗原的组织阳性对照：

明确有被测抗原的组织如转染某种质粒的细胞和没转染的细胞,23,染色-分步向组织片上滴加抗体一抗、二抗、复合物显色,Streptavidin,Enzyme,biotin,脊状分子,无生物素,24,一抗：

鼠抗、兔抗即用型、浓缩型、自制抗体选择适当的稀释度（浓缩型、自制抗体）一定要找到两个端点稀释度恰当的标准：

最好的阳性显色和最低的背景,25,二抗及以后的试剂为试剂盒，浓度不要调整。

但要决定用什么厂家、品牌的试剂盒。

试剂盒抗兔、抗鼠、抗兔/鼠什么工作原理SABC、SP、Envision厂家：

迈新（福州）、Dako等,26,时间和温度：

一抗4过夜或室温1小时其它室温10-30分钟,注意点：

用湿盒、组织不能干、抗体覆盖组织、50ul/张试剂4保存、PBS或TBS,显色显色剂,27,辣根过氧化物酶,horseradishperoxidase，HRP,酶,DABAEC,底物,HRP的优点有以下几个方面

（1）体积小（分子质量40kDa），不会遮盖抗原的结合部位，且穿透力强。

（3）具有较高活性及特异性。

（4）不溶性好，终产物不向周边扩散。

（5）组织中内源性酶较少，抑制方法较多。

催化过氧化氢分解而使其他氢供体氧化并生成水的一类酶。

以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。

28,3，3二氨基联苯胺（DAB）为棕褐色3氨基9乙基卡巴唑（AEC）为红色4氯1苯酚（CN）为蓝色DAB是广泛应用的电子供体，产物既不溶于水，又不溶于有机溶液，可长期保存。

其终产物具有嗜锇性，经锇酸处理后电子密度增加，适用于电镜下观察。

但DAB的缺点是具有潜在的致癌性，所以应尽量减少吸人和接触次数，并严格管理废液。

AEC室温下较稳定，产物不溶于水，但溶于有机溶剂，所以不能进行脱水等处理；又因其需用水溶性封固剂，时间长易褪色，限制了其应用。

29,显色的酶底物显示颜色封片辣根过氧化物酶H2O2/DAB棕色中性树胶H2O2/AEC红色甘油碱性磷酸酶NBT/BCIP深蓝色甘油,30,碱性磷酸酶AlkalinephosphataseAKP分子100kDa，穿透细胞组织的能力较弱。

某些组织细胞内含有较高的内源性碱性磷酸酶，对IHC染色会产生一定的干扰。

AKP主要用于血涂片或骨髓涂片的白细胞相关检测。

AKP的呈色反应的敏感性要比HRP高23倍，显色时间可从30min到48h，可与HRP组合进行IHC的双重或多重标记。

另外，内源性碱性磷酸酶可以在底物缓冲液中加入左旋咪唑（1evamisole）和镁离子（氯化镁），或提高底物缓冲液的pH值，可以有效地消除内源性碱性磷酸酶。

目前该酶已广泛应用于原位杂交检测的显色和双重酶标染色。

31,显色显色剂DAB棕黄色时间显微镜下控制3分钟左右，不能太快,32,复染：

苏木素（精），核染蓝色,封片：

中性树胶或甘油,DAB,AEC,33,读片,阴性对照PBS（）阴性组织（）阳性对照定位：

胞浆、胞核、胞膜、胞膜/胞浆细胞类型：

淋巴细胞、癌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞结合HE染色切片分析,34,35,这里不是癌组织，是否为非特异性染色？

不能将棕色的地方就认为是阳性。

36,上图高倍放大,37,与上同一切片的粘膜层，没有着色,38,与上同一切片，此处的粘膜层有着色，但是不是阳性，需进一步分析。

39,半定量：

根据阳性强度和分布5%或10%以下为阴性11%-25%（+）、26%-50%（+）51%-75%（+）、75%（+）数字化定量：

光密度测定（OD值）与某些生物学特性的相关性分析生长增殖、分化、转移、复发、疗效统计学处理注意：

读片的过程非常重要、要反复多看、寻找规律、提炼精华,IHC为定性结果：

阳性,40,41,谢谢！